一步式QuEChERS方法結合高效液相色譜-串聯質譜法測定牛肉中25種磺胺類藥物殘留

謝瑜杰，李鐵梅，牛相濤，張艷俠，扈 斌，吳興強，范春林，陳 輝,

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南 250101）

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是一類含有磺胺酰胺化學結構的藥物，由于該類藥物療效好、價格低，且具有良好的抗菌作用，已被廣泛用作細菌感染性疾病的預防和治療劑[1?4]。除此之外，磺胺類藥物也被當作飼料添加劑使用，對犢牛和豬進行增肥[5]，同時也可廣泛用于動物育種，治愈動物疾病并提高其抗菌能力。磺胺類藥物的大量使用造成其在肉類產品中廣泛殘留。

肉類作為當前消費者獲取蛋白的主要來源，質量安全也越來越受重視。磺胺類藥物多用于治療細菌感染，其使用量對動物而言接近中等毒性，因此，磺胺類藥物在動物體內的殘留水平通常較高[6]。雖然磺胺類藥物通過乙酰化后不會在人體內積聚，但是，濫用磺酰胺會誘使各種細菌產生對藥物的強烈耐藥性，極大地危害人體健康[5?7]。因此，建立一種快速檢測磺胺類藥物的方法尤為重要。

目前磺胺類藥物殘留主要檢測方法有HPLC[8?9]、HPLC-MS/MS[10?12]、HPLC-Q-TOF-MS[13]和HPLCQ-Orbitrap[14]等技術。高效液相色譜-串聯質譜法因其高靈敏度、高選擇性及定量定性準確等特性，成為目前獸藥殘留應用最普遍的檢測技術[11,15?16]。而針對畜禽肉的前處理方法，常見的凈化方式有固相萃取柱凈化[7,17]、液液萃取[18]和QuEChERS方法[19?20]。QuEChERS方法是當前主流前處理方法，主要應用于簡單基質，而對于動物性復雜基質很少使用。有文獻報道QuEChERS可用于魚肉、豬肉等動物性食品的凈化，可有效去除雜質干擾[20?21]。與其他前處理方法相比，傳統QuEChERS方法節省了大量時間，但仍需要人員手動完成提取和凈化兩個步驟。而一步式QuEChERS是一種通過設置儀器參數可在短時間同時完成提取和凈化兩個步驟的全自動儀器，該方式操作簡單，可減少人為參與，提高實驗效率和實現重復性[22]，一步式QuEChERS整合管如圖1所示。本文建立了一步式QuEChERS結合高效液相色譜串聯質譜法檢測牛肉中25種磺胺類藥物。該方法簡單快速、定量準確，可以為牛肉中磺胺類藥物殘留檢測提供技術支撐。

圖1 一步式QuEChERS整合管裝置Fig.1 One-step QuEChERS centrifuge tube

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉樣品 購于超市；苯甲酰磺胺、磺胺醋酰、磺胺氯噠嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺脒、磺胺甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺惡唑、磺胺、磺胺苯吡唑、磺胺吡唑、磺胺吡啶、磺胺喹噁啉、磺胺噻唑、磺胺二甲異嘧啶、磺胺異噁唑、甲氧芐啶25種磺胺類標準物質 純度≥97%，天津阿爾塔公司；乙腈 色譜純，美國Fisher公司；乙酸、無水硫酸鎂、氯化鈉、乙酸鈉、無水硫酸鈉 分析純，北京化工廠；乙酸銨 色譜純，Acros Organics公司；C1850 μm，天津博納艾杰爾公司；N-丙基乙二胺（PSA） 40~60 μm，天津博納艾杰爾公司；碳十八鍵合鋯膠（Z-Sep+） 美國Supelco公司；增強型基質去除吸附劑（EMR-Lipid） 美國安捷倫公司；鋯珠、雙層離心管 北京本立科技有限公司；實驗用水Milli-Q超純水。

Agilent 1290高效液相色譜儀和Agilent 6460三重四極桿質譜儀 配有電噴霧離子源（ESI），美國安捷倫公司；H-30全自動均質儀 中國廈門睿科儀器有限公司；SiO-6512 QuEChERS自動樣品制備系統 北京本立科技有限公司；N-EVAP 112型氮吹儀美國Organomation Associates 公司；3-30 K型高速冷凍離心機 德國Sigma 公司；Milli-Q超純水儀美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 準確稱取10 mg（精確至0.01 mg）標準品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，于?18 ℃避光保存；根據需要，移取適量儲備液，用甲醇稀釋，配制所需濃度的標準工作液，于4 ℃避光保存。

1.2.2 樣品的前處理 稱取2 g（精確至0.01 g）均勻牛肉樣品于50 mL雙層離心管外管中，加入20 mL的1%乙酸乙腈，10000 r/min均質1 min，加入1.5 g乙酸鈉和6顆鋯珠，將內管與外管擰緊（內管中含100 mg PSA，100 mg C18，200 mg無水硫酸鎂）后放入QuEChERS自動樣品制備儀器中，開始自動處理樣品。處理結束后取內管中上清液2 mL進行氮吹，氮吹至近干后用2 mL甲醇:水（2:8，v:v）定容，過0.22 μm濾膜，待LC-MS/MS檢測。

1.2.3 QuEChERS儀器參數 儀器工作程序設定為第一次振蕩轉速：1100 r/min；時間：10 min；第一次離心轉速：4500 r/min；時間：5 min；第二次振蕩轉速：1100 r/min；時間：5 min；第二次離心轉速：4500 r/min；時間：5 min。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（3 mm×150 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL；流動相：A為0.2%甲酸2 mmol/L 乙酸銨溶液，B為0.2%甲酸甲醇溶液；洗脫梯度：0~0.5 min，5% B，0.5~3 min，5%~15% B；3~10 min，15%~40% B；10~18 min，40%~100% B；18~22 min，100% B；22~22.1 min，100%~5% B；22.1~24 min，5%B；24~26 min，5% B。

1.2.5 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正離子模式；多反應監測（MRM）；毛細管電壓；4.0 kV；離子源溫度：350 ℃；去溶劑氣流：氮氣，11 L/min；去溶劑溫度：325 ℃；錐孔氣流：氮氣，8 L/min；碰撞氣壓：0.4 MPa。其他參數見表1。

表1 25種磺胺類藥物的質譜參數Table 1 MS parameters for the 25 sulfonamides

1.3 數據處理

采用Excel和Origin 8.5進行數據處理，結果采用平均值±標準偏差形式表示。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優化

2.1.1 色譜條件優化 根據文獻報道，發現磺胺類藥物流動相多使用乙腈[23]和甲醇[4]，本實驗參照農業農村部公告第197號-10-2019[24]的洗脫梯度條件，對比了乙腈和甲醇兩種有機流動相，發現甲醇作為流動相時可以提高分離效率，同時改善色譜峰形，同時為了兼顧流動相pH，本實驗最終選擇0.2%甲酸甲醇溶液作為有機流動相。

2.1.2 質譜條件的優化 在最佳色譜條件下，對1 μg/mL的25種磺胺標準溶液進行采集，通過一級質譜掃描獲得相應的母離子，并通過優化噴霧電壓、噴霧器溫度等質譜參數獲得最優離子源參數；隨后通過子離子掃描選擇信號強且穩定的碎片離子，分別確定定性離子及定量離子，進一步優化碎裂電壓、碰撞能量等參數，得到目標化合物的MRM質譜參數，具體見表1。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 提取溶劑的優化 磺胺類化合物為弱極性化合物，易于被乙腈或酸化乙腈提取[25]，同時牛肉基質相對復雜，含有大量的蛋白和脂肪等干擾物，乙腈作為提取液時，可使蛋白沉淀[26]。因此，本文對乙腈及酸化乙腈進行優化以選取最優提取條件。結果如圖2所示，當乙腈作為提取液時，4種化合物回收率小于70%，而酸化乙腈使所有化合物的回收率均提高10%左右，當提取液為2%的乙酸乙腈時，磺胺的回收率高于120%。因此，本文選擇1%乙酸乙腈作為提取液，25種磺胺類化合物回收率均在70%~120%之間。

2.2.2 提取體積及提取次數的優化 為了優化提取效率，對比了1%乙酸乙腈10 mL提取1次，提取2次和20 mL提取1次三種不同的提取次數和體積。由于10 mL提取液用量太少，借助自動QuEChERS設備不能進入內管中，因此，本實驗在對比提取液用量時選擇使用手動前處理方法。結果見圖3，10 mL提取1次時，除磺胺脒外，其余化合物回收率均高于70%，而10 mL提取2次及20 mL提取1次的回收率全部在70%~120%之間。為了減小工作量，本實驗選擇20 mL提取1次，并與自動QuEChERS前處理方法進行對比，結果發現手動前處理方法與借助自動QuEChERS設備前處理結果無顯著差距，各目標化合物回收率均大于70%。為了提高檢測效率，本實驗最終選擇提取液體積為20 mL提取一次，通過自動QuEChERS設備進行提取。

圖3 不同提取方式對化合物回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction methods on compound recovery

2.3 凈化填料的優化

對于牛肉樣品，凈化的難點在于如何有效去除脂肪干擾物。根據文獻報道，增強型去除脂類基質吸附劑EMR-Lipid可去除脂肪[27]，Z-Sep+可用于去除脂肪干擾物[28]，C18可有效去除牛肉中的脂肪和酯類；PSA可去除脂肪酸、有機酸、色素等極性物質。本文對比了500 mg EMR-Lipid、50 mg Z-Sep++200 mg C18+200 mg無水硫酸鎂、200 mg PSA+200 mg C18+200 mg無水硫酸鎂三組填料的凈化效果。從圖4可以看出，使用Z-Sep+凈化后磺胺噁唑的回收率高于120%外，其余化合物的回收率均在70%~120%之間。使用另外兩組填料時，目標化合物的回收率范圍均在70%~120%之間，考慮到EMR-Lipid在使用前需要用水活化，增加前處理步驟，最終選擇PSA+C18+無水硫酸鎂進行凈化。

乙腈1%乙酸乙腈2%乙酸乙腈(%)率收回160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40磺胺二甲嘧啶磺胺甲氧噠嗪磺胺甲基嘧啶磺胺鄰二甲氧嘧啶磺胺喹噁啉磺胺甲噁唑磺胺對甲氧嘧啶 磺胺吡唑 磺胺苯吡唑磺胺間甲氧嘧啶磺胺間二甲氧嘧啶磺胺吡啶磺胺氯吡嗪磺胺氯噠嗪磺胺二甲異嘧啶磺胺嘧啶磺胺噻唑磺胺惡唑甲氧芐啶 磺胺異噁唑磺胺甲噻二唑 磺胺苯甲酰磺胺磺胺醋酰磺胺脒化合物名稱

圖4 不同填料對化合物回收率的影響Fig.4 Effect of different adsorbents on compound recovery

由于牛肉中含水量較少，主要去除的干擾物是蛋白質和脂肪，因此本文主要優化C18和PSA用量，對無水硫酸鎂只考察使用和不使用時對化合物回收率的影響。對比C18用量為100、200和300 mg時的回收率，結果發現，隨著C18用量的增加，部分化合物的回收率會降低，當用量為100 mg時，25種化合物的回收率均在70%~120%之間，詳見圖5。對比PSA用量發現，當用量為100 mg時，目標化合物的回收率均在70%~120%之間，且回收率明顯高于200 mg和300 mg，詳見圖5；在C18和PSA用量均為100 mg時，對未使用無水硫酸鎂和用量200 mg時目標化合物回收率進行了考察，結果發現，使用無水硫酸鎂時多種化合物的回收率高于未使用無水硫酸鎂時化合物的回收率，以苯甲酰磺胺最為明顯。因此，本文選擇的最佳凈化填料組合為PSA 100 mg、C18100 mg和無水硫酸鎂200 mg。

圖5 不同填料用量對化合物回收率的影響Fig.5 Effect of different adsorbent dosage on compound recovery

2.4 定容液的選擇

本文使用的流動相為0.2%甲酸（含2 mmol/L NH4Ac）水溶液和0.2%甲酸甲醇溶液，且初始流動相為95%水相，因此，定容液的選擇也尤其重要。在相同濃度下，對比了不同定容液對目標化合物的影響，當乙腈和甲醇作為定容液時，目標化合物響應均較低，溶劑效應明顯，尤其以極性較大的化合物最明顯，如磺胺。因此對定容溶液進一步優化，主要增加水的比例，選擇甲醇:水（8:2、5:5、4:6:2:8）四種情況，以磺胺為例，當定容液接近初始流動相時，即甲醇:水（2:8）時磺胺響應逐漸提高，且峰形逐漸改善，見圖6。

圖6 不同定容液對化合物的影響Fig.6 Influence of different constant volume solutions on compounds

2.5 基質效應

以陰性空白樣品提取液作為溶劑，配制100 μg/L的混合標準溶液，測定其峰面積為A；以甲醇為溶劑配制100 μg/L的混合標準溶液測定其峰面積為B。基質效應 ME（%）=B/A×100。根據受到基質效應的強弱，將基質效應分為三類：ME%值低于?20%表現為基質抑制效應；ME%值介于?20%和20%之間表現為弱基質效應；ME%值高于20%表現為基質增強效應。結果表明：25種磺胺類化合物均為弱基質效應，見表2。為了定量更準確，本文采用基質匹配標準溶液進行定量。

表2 牛肉中25種磺胺類化合物的基質效應Table 2 Matrix effect for 25 sulfonamides in beef

2.6 方法學評價

2.6.1 線性范圍、檢出限與定量限 在陰性樣品中添加目標化合物，按照1.3步驟測定，以信噪比S/N≥3對應添加水平作為檢出限（LOD），信噪比S/N≥10對應的添加水平作為定量限（LOQ），結果見表3。結果顯示該方法的檢測限在1~3 μg/kg之間，定量限在1~10 μg/kg之間。25種磺胺類化合物在0.1~20 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數（r）均高于0.990（見表3）。

表3 磺胺類藥物線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限和定量限Table 3 Linear range, regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of SAs

2.7 回收率與精密度

為了考察方法的準確度和精密度，對陰性牛肉樣品進行添加回收試驗。分別選擇1倍LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ的混合標準工作液作為添加水平，按前述方法進行前處理，每個添加水平測定5個平行。同時進行空白實驗，扣除本底值后計算添加回收率和相對標準偏差。牛肉中25種化合物在1倍LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ添加水平下的回收率分別為70.44%~116.93%、70.14%~91.73%和72.14%~93.62%，相對標準偏差范圍分別為0.95%~12.17%、4.07%~13.74%和1.18%~10.74%，結果見表4，表明該方法的準確度和精密度滿足準確定量的要求。

表4 準確性和精密度實驗結果（n=5）Table 4 Accuracy and precision of the method (n=5)

2.8 實際樣品測定

應用本文建立的檢測方法對8份市售牛肉樣品中25種磺胺類化合物進行了測定，檢測結果顯示，25種磺胺類化合物在市售牛肉樣品中均未檢出。

3 結論

本研究建立了自動QuEChERS結合高效液相色譜-串聯質譜方法檢測牛肉中25種磺胺類合成抗菌藥物。對提取液、提取方式、凈化條件及定容液等方面進行優化，最終選取1%乙酸乙腈作為提取液，PSA+C18+無水硫酸鎂（1+1+2，質量比）凈化提取液，HPLC-MS/MS檢測，基質匹配外標法定量，該方法具有簡單、快速、靈敏度高，降低了基質干擾等優勢，可推廣用于以牛肉為代表的畜禽肉中25種磺胺類合成抗菌藥物的檢測。