高效液相色譜法測定雞蛋、雞肉中五種類胡蘿卜素物質

蘭 韜，閆 娜,2，裴 棟，劉佳雯,2，于聰聰，初 僑，李篤信

（1.中國標準化研究院，北京 100191；2.蘇州大學藥學院，江蘇蘇州 215006；3.青島市資源化學與新材料研究中心，山東青島 266000）

斑蝥黃（Canthaxanthin，C40H52O2）又稱角黃素，屬于類胡蘿卜素[1]，可通過家禽消化道吸收并最終富集于蛋黃[2]，是一種較為常用的飼料添加劑。葉黃素、玉米黃素、蝦青素、β-胡蘿卜素等都屬于類胡蘿卜素，被廣泛用于食品、醫藥、化妝品、飼料等行業[3?4]。這些色素能提高肉雞皮膚、腳脛和胴體的顏色，使雞肉的新鮮度和健康度提高，提高雞肉制品的附加值[5]。同時這些色素也可以加深蛋黃色澤，有商家就把這種“美容蛋”冒充土雞蛋，賺取高額差價[6]。2019年“3.15”央視晚會也報道了斑蝥黃染色雞蛋冒充土雞蛋的問題，引起了社會的廣泛關注[7]。

這些著色劑在低劑量時對人體具有一定的保健作用[8]，但是如果過量攝入可能會對人體造成一定的危害，如斑蝥黃積累會造成視力減退等眼疾[9]，所以歐盟于2003年規定飼料中斑蝥黃的含量為25 mg/kg[10]，聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織聯合食品添加劑專家委員會規定斑蝥黃每日允許攝入量為0.03 mg/kg BW[11]，日本“肯定列表制度”規定禽蛋中斑蝥黃的最大殘留限量為0.1 mg/kg[12]，我國也在2018年《飼料添加劑安全使用規范》中規定飼料中斑蝥黃的限量為25 mg/kg[13]。因此，建立禽蛋制品中斑蝥黃等色素含量的檢測方法標準以監控色素的使用勢在必行。

目前針對天然色素的檢測方法主要包括分光光度計法[14]、高效液相色譜法[15?17]、液相色譜-質譜聯用法[18?20]等，其中高效液相色譜法分析速度快，普及率高，成為分離此類物質的首選方法。然而玉米黃質和葉黃素兩者互為異構體，分離起來比較困難，對其分離仍然是一項挑戰[21]。通過查閱文獻資料發現，我國針對這些著色劑分別制定了相應的檢測方法標準[22?23]，并做了系列研究[24?25]。其中，分析檢測主要采用高效液相色譜法（HPLC）。然而這些標準和研究都以飼料或肉為基質，而且基本都是只針對一到兩種著色劑進行檢測，較少涉及復雜基質中多種色素的同時檢測。因此，本文基于HPLC法建立了同時測定雞蛋、雞肉等復雜基質中5種類胡蘿卜素色素的檢測方法。并通過方法學考察，實現方法的標準化，為相關產品的質量控制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋、雞肉 采購于北京當地超市，將雞蛋、雞肉樣品凍干后研磨成粉末，保存于?18 ℃冰箱；蝦青素（Astaxanthin）、葉黃素（Xanthin）、斑蝥黃（Canthaxanthin）、玉米黃素（Zeaxanthine）、β-胡蘿卜素（β-carotene）標準品 保存在4 ℃冰箱，美國Cerilliant公司；乙腈、二氯甲烷、甲醇（色譜純） 德國默克公司（中國）。

iChrom5100分析型 國產液相色譜儀（配DAD檢測器）、Supersil-ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 大連依利特分析儀器有限公司；Thmorgan-VM200型渦旋振蕩器 托摩根生物科技有限公司；HITACHI-CF15RXII離心機 日立公司；Sartorius分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；ELGA純水儀 北京誠驛恒儀科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 分別準確稱取50.0 g（精確到0.001 g）雞蛋、雞肉樣品，用高速組織搗碎機充分搗碎、混勻，形成雞蛋、雞肉樣品粉末，裝入密封瓶保存。

分別采用兩種樣品提取凈化方法進行了對比和優化，其中方法1具體操作方法為：稱取試樣約5.0 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入30 mL乙腈提取劑及10 g無水硫酸鈉后，渦旋混合1 min，在35 ℃以下水浴超聲提取10 min，再以3000 r/min離心5 min。將上清液移入預置有20 mL正己烷的125 mL分液漏斗中，振搖0.5 min后，靜置分層；收集下層乙腈相，正己烷相留在分液漏斗，待本試樣后續脫脂重復使用。按上述步驟對離心管中的殘留物每次用20 mL乙腈提取劑再重復提取兩次，所得提取液用上述正己烷相依次脫脂。合并三次脫脂后所收集的乙腈相，加入5 mL正丙醇，于40 ℃以下旋轉蒸發濃縮至近干，用乙腈溶解并定容至5.0 mL，0.20 μm濾膜過濾，濾液待測。測定操作應避強光、連續進行。

方法2為QuEChERS方法，分別準確稱取5.0 g（精確到0.001 g）雞蛋、雞肉樣品粉末于50 mL離心管，加入30 mL 60%二氯甲烷/乙腈溶液進行提取，并加入10 g無水硫酸鈉，渦旋1 min，35 ℃水浴超聲10 min，離心3500 r/min 5 min，過0.22 μm濾膜，得基質溶液。

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 標準儲備液 取蝦青素、葉黃素、玉米黃素、斑蝥黃、β-胡蘿卜素標準品各2 mg，分別溶于1 mL二氯甲烷中，分別制得2 mg/mL的五種類胡蘿卜素標準品溶液。分別取500 μL各種類胡蘿卜素標準品溶液入10 mL棕色容量瓶，并加入3.5 mL二氯甲烷，并用乙腈定容，得到10 mL 100 μg/mL的混合標準品（60%二氯甲烷/乙腈），4 ℃冰箱冷藏保存，有效期為6個月。

1.2.2.2 標準工作溶液 準確吸取混合標準儲備液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mL分別置于10 mL容量瓶中，用60%二氯甲烷/乙腈溶液定容，配制為質量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的系列混合標準工作液，現用現配。

1.2.2.3 基質標準儲備溶液 分別取2 mg/mL的蝦青素、葉黃素、斑蝥黃、β-胡蘿卜素、玉米黃素各500 μL入10 mL棕色容量瓶，以基質溶液定容，得到總體積為10 mL100 μg/mL的基質標準儲備溶液，4 ℃冰箱冷藏保存，有效期為6個月。

1.2.2.4 基質標準工作溶液 準確吸取混合標準儲備液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mL分別置于10 mL容量瓶中，用基質溶液定容，配制為質量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的系列基質標準工作溶液，現用現配。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱：Supersil-ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。柱溫：30 ℃。進樣量：10 μL。流速：1.0 mL/min。檢測波長：470 nm。洗脫時間：20 min。流動相分別采用流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液的體系1；流動相A為乙腈，流動相B為氯仿的體系2；流動相A為乙腈，流動相B為二氯甲烷的體系3這三個體系進行優化。最后選擇流動相A為乙腈，流動相B為二氯甲烷（使用前經有機相濾膜抽濾，超聲脫氣）。梯度洗脫程序：0~13 min，3%B；13~17 min，3%~90%B；17~20 min，90%~3%B。

1.2.4 標準曲線繪制 將配制好的0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/mL混合標準工作溶液按“1.2.3”的液相色譜條件進樣分析，分別以5種化合物的濃度為橫坐標，峰面積響應值為縱坐標，繪制系列標準曲線，進行線性回歸，得到5種類胡蘿卜素的標準曲線線性回歸方程。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 定量限、檢出限 將1.2.2.2的標準工作溶液按“1.2.3”的液相色譜條件測定，測得5種類胡蘿卜素的峰面積，帶入相應物質的標準曲線回歸方程中。以最低水平標準溶液中目標組分的3倍平均信噪比為檢出限（LOD），10倍平均信噪比為定量限（LOQ），計算得本方法的LOD和LOQ。

1.2.5.2 重復性實驗 在相同的儀器條件下，精密稱取0.5 g（精確到0.001 g）雞蛋或雞肉粉末樣品6份，分別加標1.0 μg/mL的混合標準工作液0.5 mL，按“1.2.1” 項下方法操作，將處理好的6份待測液按“1.2.3”色譜條件進樣分析，測得5種類胡蘿卜素類物質的峰面積，代入標準曲線方程，計算測定濃度的標準偏差RSD。

1.2.5.3 加標回收率 分別準確稱取5.0 g（精確到0.001 g）雞蛋、雞肉樣品粉末各12份于50 mL離心管，編號1~12，其中1~3號作為本底，4~6號加標配成1 mg/kg待測液，7~9號加標配成10 mg/kg待測液，10~12號加標配成20 mg/kg待測液，加入30 mL 60%二氯甲烷/乙腈溶液，并加入10 g無水硫酸鈉，渦旋1 min，35 ℃水浴超聲10 min，離心3500 r/min 5 min，過0.22 μm濾膜，將處理好的待測液以及低、中、高3種濃度的加標樣品經HPLC分析，測得峰面積，計算回收率。

1.2.5.4 基質效應 本研究以“1.2.3”色譜條件對雞蛋、雞肉樣品不含基質的標準工作溶液標準工作溶液和含基質的標準工作溶液分別進行分析，分別對比雞蛋、雞肉樣品不含基質的標準工作溶液標準曲線（A1、A2）和含基質的標準工作溶液標準曲線（B1、B2）的斜率。分別計算各目標物的標準曲線方程的斜率比。

1.3 數據處理

本文標準曲線線性回歸方程及相關系數由依利特ichrom5100 workstation處理所得，其他數據采用Origin 8.5和Excel 2010軟件對數據進行處理并作圖，實驗數據取3次平行實驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 前處理方法優化

大多數類胡蘿卜素可溶解于大部分有機溶劑中，不溶于水。這五種類胡蘿卜素均具有較強的極性，在二氯甲烷中具有較好的溶解度[26]。文獻報道丙酮、乙腈、二氯甲烷/乙腈、甲醇/二氯甲烷等極性有機溶劑的提取效果均能滿足要求，但用乙腈提取對動物性基體具有可減少脂肪進入提取液的優點[27]。故先采用乙腈提取，正己烷脫脂。但發現樣品中類胡蘿卜素類物質有損失，回收率較低，所以選擇不用正己烷脫脂。又采用純二氯甲烷提取，發現雞蛋液漂浮在上方，不易分離以及過濾。因而選擇60%二氯甲烷/乙腈溶液進行提取，回收率較好，具有較好的提取效果。兩種提取溶劑體系的提取結果如表1所示。同時加無水Na2SO4有助于吸收樣品中水分，改善提取效果[28]。

表1 2種不同溶劑提取結果對比Table 1 Comparison of extraction results of two different solvent

2.2 液相色譜條件優化

本實驗對比了乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-氯仿和乙腈-二氯甲烷三個流動相體系下，對于5種類胡蘿卜素的分離情況，結果如圖1所示。從圖1中可以看出，乙腈?0.1%甲酸水溶液體系下，由于樣品脂溶性較強，析出現象比較嚴重，有些物質可能已經析出，不利于樣品分離。乙腈-氯仿體系分離的各個組分出峰時間較長，分析時間需要40 min左右，分析效率較差。而乙腈-二氯甲烷體系下分離的各個組分出峰較快，峰性尖銳，各物質均得到了較好分離，結果如圖1所示，可見在最佳條件下5種類胡蘿卜素的分離度良好，在20 min內可完成5種色素的基線分離。故本實驗選用乙腈-二氯甲烷作為本實驗流動相體系。

圖1 三種流動相體系下5種類胡蘿卜素的色譜分離圖Fig.1 Chromatogram of 5 carotenes under three mobile phase systems

2.3 標準曲線、定量限、檢出限

以該方法對5種類胡蘿卜素混合標準工作溶液進行測定，以最低水平標準溶液中目標組分的3倍平均信噪比為檢出限（LOD），10倍平均信噪比為定量限（LOQ），計算得本方法的LOD和LOQ。其線性范圍、相關系數、LOD及LOQ如下表2所示。從表2可以看出，這5種類胡蘿卜素在0.5~100 μg/mL線性范圍內有較好的線性關系，決定系數R2均>0.996。經計算，5種類胡蘿卜素物質的檢出限（LOD，S/N=3）均在0.10~0.20 mg/kg之間，定量限（LOQ，S/N=10）均在0.33~0.66 mg/kg之間。

表2 5種類胡蘿卜素物質的線性范圍、LOD和LOQ Table 2 Linear range, LOD and LOQ of 5 carotenes

2.4 重復性試驗

本文對該HPLC方法的重復性進行了考察，在相同的儀器條件下，按照1.2.5.2實驗步驟，分別測得平行6組雞肉和雞蛋中蝦青素、葉黃素、斑蝥黃、β-胡蘿卜素、玉米黃素五種物質的濃度及RSD如下表3所示。6次重復試驗的濃度RSD均小于5%，說明方法的重復性較好。

表3 方法的重復性試驗結果（n=6）Table 3 Repeatability test results of this method(n=6)

2.5 方法的回收率

為了驗證方法的可靠性，本文對雞蛋、雞肉樣品進行加標回收實驗，加標水平均為1、10、20 mg/kg的混合標準品，每個加標水平做6次平行實驗，經處理后上機分析。方法回收率和精密度列于表4中。對于雞蛋樣品的加標回收試驗來說，在3個加標水平下，5種類胡蘿卜素的平均回收率在71.6%~112.9%之間，RSD≤6.9%；對于雞肉樣品的加標回收實驗來說，在3個加標水平下，5種類胡蘿卜素的平均回收率在88.6%~119.7%之間，RSD≤7.2%。該結果表明，本研究建立的檢測方法在不同加標水平下，具有較高的回收率和良好的精密度，能夠滿足多種雞蛋、雞肉樣品中5種類胡蘿卜素類物質檢測的要求。

表4 雞蛋、雞肉樣品的加標回收試驗結果Table 4 Recoveries of 5 carotenes in egg and chicken samples

2.6 基質效應

基質效應的存在使得在實際的痕量物質檢測過程中，當使用純溶劑標準曲線進行校準時，常常會引起分析結果的偏差和對樣品制備過程回收率的錯誤估算[29]。對基質效應不明顯的樣品，其基質標準曲線和溶劑標準曲線基本重合。基質效應為基質匹配校準曲線的斜率與溶劑標準校準曲線的斜率兩者之比，比值越接近1，則基質效應越小[30?31]。本研究通過分別對比雞蛋、雞肉樣品不含基質的標準工作溶液標準曲線（A）和含基質的標準工作溶液標準曲線（B）的斜率，以表征5種色素的基質效應，結果見表5。結果表明，雞蛋樣品中，蝦青素、葉黃素、玉米黃素和斑蝥黃的基質效應不明顯，β-胡蘿卜素存在一定的基質增強效應；雞肉樣品中，葉黃素和玉米黃素的基質效應不明顯，蝦青素、斑蝥黃和β-胡蘿卜素存在明顯的基質減弱效應，綜上所述，雞蛋、雞肉樣品均需要基于基質溶液進行實驗。所以后續實驗均基于基質溶液進行。

表5 雞蛋、雞肉樣品的基質效應Table 5 Matrix effect of egg and chicken samples

2.7 實際樣品測定

以本方法的提取工藝和色譜條件對市售的雞蛋和雞肉樣品中的五種類胡蘿卜素類物質進行了分離分析，各物質含量的計算結果如表6所示。實際樣品分析結果表明，雞蛋和雞肉中均有五種類胡蘿卜素類物質檢出，但是含量都較少，其中有部分雞蛋和雞肉樣品檢出斑蝥黃，可能存在一定斑蝥黃添加劑飼喂的現象，但是檢出量較低，未超過標準規定的限值。說明我國在相關飼料添加劑的使用方面管控較嚴。

表6 不同雞蛋雞肉樣品中5種類胡蘿卜素含量Table 6 Contents of 5 carotenes in egg and chicken samples

3 結論

本文借鑒了QuEChERS凈化方法，基于雞蛋、雞肉和五種類胡蘿卜素類物質的特性，對基質的提取凈化方法以及目標物的檢測方法進行了優化，建立了雞蛋、雞肉中五種類胡蘿卜素的HPLC檢測方法，使一次性同時檢測復雜基質中5種主要類胡蘿卜素的含量成為可能。該方法對5種類胡蘿卜素在0.5~100 μg/mL線性范圍內有較好的線性關系，決定系數R2均大于0.996，方法的檢出限均在0.10~0.20 mg/kg之間，定量限在0.33~0.66 mg/kg之間。在1、10、20 mg/kg的加標水平下，雞蛋和雞肉樣品的加標回收率分別在71.6%~112.9%和88.6%~119.7%之間，RSD≤7.2%。該方法具有定量準確、操作簡便、省時省力的優點，可用于色素飼喂的土雞蛋、雞肉的真偽鑒別，降低檢測機構和企業的檢測成本，促進市場監管的便利化。