高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定鲆鰈類水產(chǎn)品中喹諾酮的不確定度評定

范廣宇 ，唐 秀，張 琳，李配婷，陳振玲

（1.連云港海關(guān)，江蘇連云港 222042；2.鹽城海關(guān)，江蘇鹽城 224002；3.貴州理工學(xué)院，貴州貴陽 550003）

喹諾酮類藥物是一類廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的人工合成抗菌藥物，用來預(yù)防和治療動物疾病，具有廣譜、高效、價廉等特點(diǎn)[1?2]，但誤用、濫用等不合理使用喹諾酮類藥物不僅會使其在環(huán)境中殘留，還會對人體健康造成危害[3?5]。許多國家和地區(qū)、國際組織都對喹諾酮在水生動物和水產(chǎn)品中的殘留作出了規(guī)定。中國原農(nóng)業(yè)部公告第2292號宣布停止生產(chǎn)用于食品動物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑。其他國家的要求也越來越高，如輸往韓國的養(yǎng)殖水產(chǎn)品中諾氟沙星、培氟沙星和氧氟沙星的限量要求不得檢出[6]。鲆鰈類魚一般指身體扁平，眼在頭部一側(cè)的鰈形目魚類，包括鰈科、鰨科和鲆科等，是我國重要的養(yǎng)殖海水魚類[7?8]，根據(jù)中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒2018年鲆魚和鰈魚養(yǎng)殖年產(chǎn)量分別為10.8萬噸和1.4萬噸[9]。水產(chǎn)品中的喹諾酮類藥物殘留量小，樣品基質(zhì)復(fù)雜，需要高效的前處理和檢測技術(shù)，目前水產(chǎn)品中應(yīng)用較多的前處理技術(shù)有液液萃取法[10?12]、固相萃取法[13?14]和QuEChERS法[15?16]等，而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的分析時間短、檢出限低、準(zhǔn)確性和靈敏度高，是喹諾酮類藥物殘留檢測中應(yīng)用較廣的儀器檢測方法[17?19]。

測量不確定度用來表征被測量值的分散性[20?21]，可以體現(xiàn)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，測量不確定度的評定是食品檢測中質(zhì)量控制的重要內(nèi)容[22?23]。本文參考SN/T 1751.2-2007 《進(jìn)出口動物源食品中喹諾酮類藥物殘留量檢測方法 第2部分：液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》建立了鲆鰈類水產(chǎn)品中我國已停用的4種喹諾酮類藥物殘留的檢測方法[24]，參照已經(jīng)報道的動物源性食品中獸藥殘留檢測中的不確定度的評定方法[25?28]，對不確定度的來源分析和量化，為鲆鰈類水產(chǎn)品中喹諾酮類殘留檢測過程質(zhì)量評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

諾氟沙星（norfloxacin, 純度≥99.6%）、培氟沙星（pefloxacin, 純度≥92.1%）、氧氟沙星（ofloxacin, 純度≥99.3%）、洛美沙星（lomefloxacin, 純度≥99.4%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈（色譜純） 德國Merck公司；其他試劑 為國產(chǎn)優(yōu)級純；實驗用水 為自制超純水；石鰈、星斑川鰈、半滑舌鰨等鲆鰈類樣品 采購自本地市場。

QTRAP 4500型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備有電噴霧離子源（ESI） 美國AB SCIEX儀器公司；XS 205型分析天平 瑞士Metller Toledo公司；Milli-Q純水儀 美國Millipore公司；N-EVAP 112氮吹儀 美國Organomation公司。

1.2 實驗方法

參考SN/T 1751.2-2007《進(jìn)出口動物源食品中喹諾酮類藥物殘留量檢測方法 第2部分：液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》中的前處理方法并改進(jìn)。

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)純度折算后為10 mg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解定容。

10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別取適量單標(biāo)儲備液用甲醇稀釋，使用前稀釋至所需濃度。

1.2.2 樣品前處理 稱取5.00 g制備均勻的樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL含1%（V/V）乙酸的乙腈旋渦混勻后超聲提取10 min，3500 r/min離心5 min，取上清液到另一離心管中。重復(fù)提取一次，合并上清液。加入5 mL正己烷旋渦混合1 min，3500 r/min離心5 min后取乙腈層于氮?dú)饬飨麓蹈桑? mL甲醇?0.1%（V/V）甲酸水溶液（1:9）溶解定容，過0.22 μm有機(jī)濾膜，儀器測定。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 液相色譜條件 色譜柱：ACE UltraCore 2.5 Super C18柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動相0.1%（V/V）甲酸水溶液和甲醇；流速0.3 mL/min；流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測模式；去溶劑溫度500 ℃；電噴霧電壓5.5 kV；入口電壓和碰撞室出口電壓分別為10、6 V；氣體均為高純氮?dú)猓慌鲎矚狻夂煔狻㈧F化氣、輔助氣壓力分別為41.4、207、345、345 kPa。4種喹諾酮類藥物質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 4種喹諾酮類藥物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of 4 quinolones

1.2.4 數(shù)學(xué)模型 根據(jù)鲆鰈類水產(chǎn)品中喹諾酮類殘留的測定方法，待測物在樣品中的殘留量計算公式如下：

式中：X—樣品中喹諾酮的殘留量，μg/kg；c—喹諾酮的校準(zhǔn)濃度，μg/L；V—定容體積，mL；fR—回收率校正因子，等于回收率的倒數(shù)；m—試樣溶液代表的樣品質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和樣品含量采用MultiQuant軟件處理，文中數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差等采用Excel軟件處理，公式采用Microsoft公式編輯器軟件編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的主要來源

根據(jù)數(shù)學(xué)模型，不確定度主要有以下幾方面：a.校準(zhǔn)濃度的不確定度，包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀等的不確定度；b.樣品質(zhì)量的不確定度，主要是天平的校準(zhǔn)的不確定度；c.定容體積的不確定度；d.回收率的不確定度，方法前處理過程復(fù)雜，步驟較多，采用對樣品添加回收對樣品處理過程的不確定度進(jìn)行評定；e.隨機(jī)效應(yīng)的不確定度，包括稱量的重復(fù)性、體積的重復(fù)性、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的重復(fù)性等引入的不確定度等。詳見圖1。

圖1 鲆鰈類水產(chǎn)品中4種喹諾酮類藥物殘留不確定度來源Fig.1 Uncertainty sources for determination of 4 quinolones residues in flatfish

2.2 校準(zhǔn)濃度的不確定度urel（c）

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的不確定度urel（p） 喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度（p）及擴(kuò)展不確定度（Up）見表3，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算公式為相對不確定度計算公式為4種喹諾酮純度的相對不確定度計算結(jié)果見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度及不確定度Table 3 Purity and uncertainty of standard materials

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制的不確定度urel（s） 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制過程參照標(biāo)準(zhǔn)，分別稱取按照純度折算相當(dāng)于10 mg的喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解定容于50 mL容量瓶中，包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量的不確定度和50 mL容量瓶的不確定度。

a.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量的不確定度urel（m1）

查詢天平的校準(zhǔn)證書，其擴(kuò)展不確定度為0.05 mg（k=2），則2次稱量過程（去皮和稱樣）產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：詳見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制的不確定度Table 4 Uncertainty of standard stock solutions

b. 50 mL容量瓶的不確定度urel（V50mL）

根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[29]，A級50 mL容量瓶的容量允差為±0.05 mL，按三角分布則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為在20±5 ℃下操作，甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.18×10?3，按均勻分布，則由溫度效應(yīng)引入的體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：則50 mL容量瓶的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：0.171mL，相對確定度為：

2.2.3 配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度urel（ms）

a.10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制引入的不確定度urel（10 mg/L）

移取5 mL 4種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容。A級單標(biāo)線5 mL吸量管的容量允差為±0.015 mL，按三角分布，則u(V3)=

A級100 mL容量瓶的容量允差為±1 mL，按三角分布，則在20±5 ℃下操作，甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.18×10?3，按照均勻分布則由溫度效應(yīng)引入的體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度

b.0.5 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制引入的不確定度urel（0.5 mg/L）

2.2.5 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)的不確定度urel（cal） 5個濃度標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別上機(jī)測定3次，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，3次進(jìn)樣定量離子對平均峰面積為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法擬合，得到線性回歸方程A=ac+b（a為斜率，b為截距）和線性相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果見表6。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合標(biāo)準(zhǔn)偏差按照下列公式計算：

式中：ci為標(biāo)準(zhǔn)系列濃度，Ai為對應(yīng)的峰面積，a為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，b為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距，n為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液測定總次數(shù)（本實驗為5×3=15）。

樣品平行測定3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得平均濃度。則擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按下式計算：

式中：S（A）如前所述；a為斜率；p為測定次數(shù)，這里為3；n=15；c為樣品平均濃度為標(biāo)準(zhǔn)系列的平均濃度，這里為33.2 μg/ L；

由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的相對不確定度計算結(jié)果見表6。

表6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合的不確定度Table 6 Uncertainty of standard curve

2.2.6 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的不確定度urel（LCMS） 查詢高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的校準(zhǔn)證書，儀器的相對擴(kuò)展不確定度為5.2%（k=2），則由高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀引入的相對不確定度urel（MS）為0.026。

2.2.7 校準(zhǔn)濃度的不確定度的合成 綜合以上各分量，得出校準(zhǔn)濃度引入的不確定度計算公式：urel(c)=4種喹諾酮類藥物校準(zhǔn)濃度的不確定度計算結(jié)果為：urel（c）氧氟沙星=0.0468；urel（c）培氟沙星=0.0522；urel（c）諾氟沙星=0.0649；urel（c）洛美沙星=0.0478。

2.3 樣品質(zhì)量的不確定度urel（m）

稱樣量為5.00 g，電子天平的校準(zhǔn)證書給出擴(kuò)展不確定度為0.05 g（k=2），稱量2次（一次去皮，一次稱樣），標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對不確定度分別為：

表5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的不確定度Table 5 Uncertainty of standard solution preparation

2.4 定容體積的不確定度urel（V）

2.5 回收率的不確定度urel（R）

2.6 隨機(jī)效應(yīng)的不確定度urel（A）

隨機(jī)效應(yīng)的不確定度包括由稱量、定容等過程中隨機(jī)效應(yīng)不確定度的加和，為不確定度的A類評定，采用對同一樣品平行測定6次，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表8。

表8 隨機(jī)效應(yīng)的不確定度Table 8 Uncertainty of repeatability

2.7 合成不確定度

2.8 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果報告

表10 鲆鰈類水產(chǎn)品中4種喹諾酮類殘留測定不確定度評定結(jié)果Table 10 Uncertainty evaluation result for determination of 4 quinolones residues in flatfish

3 結(jié)論

本研究建立了測定鲆鰈類水產(chǎn)品中氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星和洛美沙星殘留量過程中的不確定度評定方法，分析不確定度的來源并計算，得出擴(kuò)展不確定度并報告了檢測結(jié)果。從評定結(jié)果看，不確定度的主要貢獻(xiàn)來自于標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，應(yīng)當(dāng)注意標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制和保持儀器的良好狀況。不確定度的評定和分析對進(jìn)出口鲆鰈類水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留檢測中的質(zhì)量控制有參考意義。

表7 回收率的不確定度Table 7 Uncertainty of recoveries

表9 不確定度分量匯總表Table 9 Summary of each uncertainty component