豇豆淀粉的提取及理化性質研究

李家豪，張善英，任賽豪，王 萌 ，章程輝,

（1.海南大學食品科學與工程學院，海南海口 570228；2.農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室（海口），海南海口 570228；3.海南大學植物保護學院，海南海口 570228）

豇豆（Vigna unguiculata（L.）Walp.）是一種在世界范圍內廣泛種植的重要豆科植物，特別是在熱帶和亞熱帶地區廣泛種植[1?2]。長豇豆（Vigna unguiculata（L.）Walp. ssp.unguiculatacv.-gr.sesquipedalis）（2n=2x=22）是豇豆的一種，是在我國廣泛種植的重要栽培亞種[3]。在西非等地區，豇豆籽被單獨蒸煮作為主糧或者與其他作物混合食用，而在我國，豇豆長期以來被廣泛地作為蔬菜食用。

據報道，豇豆籽含有50%~66%的淀粉和16%~31%的蛋白質，是淀粉和蛋白質的優質廉價來源[4]。豇豆淀粉因為直鏈淀粉含量高、抗剪切能力強、老化速度快并且抗性淀粉高（9.42%~32.14%），越來越受到研究人員的關注[5]。豇豆淀粉也是一種適合于食品工業的質構改良劑[6]，其具有良好的耐酸和耐酶解的能力，并且老化特性突出[7]。隨著食品市場的進一步發展，人們對具有較好新功能的替代淀粉來源需求激增，豇豆非常適合作為一種新型的工業淀粉新來源[8]。

長豇豆長期被作為一種蔬菜食用，研究人員對長豇豆的關注點主要集中在農藥殘留等方面，而對其潛在應用前景缺乏研究。其中對長豇豆淀粉的研究更是極為有限，特別是在提取、結構和性質等方面鮮有報道。本文以長豇豆為主要研究對象，研究豇豆淀粉的提取工藝及其結構與理化性質，為豇豆淀粉在食品工業及其他相關領域的研究和應用提供一定的理論基礎與數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長豇豆 于2020年收獲自海南大學實驗基地（N20°03′22″，E110°19′20″），平均溫度與相對濕度為27~34 ℃和63%~82%，收獲時長豇豆處于開花結莢期，種子完全成熟，籽粒飽滿；總淀粉含量測定試劑盒（Total Starch Assay Kit） 愛爾蘭Megazyme；其余化學試劑 均為分析純。

Verios G4 UC型場發射掃描電子顯微鏡 美國賽默飛世爾科技公司；T27型傅立葉變換紅外光譜儀德國布魯克公司；Q600型熱重分析儀、DSC250型差示掃描量熱儀 美國TA公司；Smart Lab X射線衍射儀 日本理學株式會社；ZS90型激光粒度儀英國馬爾文公司；FiveEasy Plus FE28型pH計美國梅特勒-托利多公司；QUINTIX124型電子天平德國賽多利斯科學儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豇豆淀粉的提取工藝 豇豆淀粉的提取工藝改進自Ratnaningsih等[9]、王苗苗等[10]的方法。去除長豇豆的莢，得到豇豆樣品，將100 g豇豆4 ℃下浸泡于0.05 mol/L NaOH溶液中一定時間，加500 mL水兩次磨漿后過150目篩收集豆漿，在豆漿中加入酸調節pH為6左右靜置過夜，離心（3000×g，10 min）后取沉淀，用乙醚除脂肪后置干燥箱中烘干過夜，即得粗提物。取粗提物加水配制成乳液，加入一定量的無水乙醇于三角瓶中，在搖床中振蕩后取出，離心（3000×g，10 min），沉淀中加入水洗滌3次后烘干過夜。平行實驗三次后計算平均提取率。豇豆淀粉的提取路線如圖1：

圖1 豇豆淀粉的提取流程圖Fig.1 Flow chart of extraction of cowpea starch

1.2.2 單因素實驗 目前，豆類淀粉提取方面研究通常參照薯類淀粉提取方面的研究指標，以得率與提取率為衡量提取工藝的指標。因此本文根據此基礎進行了修改，將所提取淀粉的純度引入計算中，亦使用得率與提取率這一指標，以下式表示：

式中：m1：提取淀粉的質量（干基），g；m2：原料干重，g。

式中：m1：提取淀粉的質量（干基），g；ω1：提取淀粉的純度，%；m2：原料干重，g。

式中：f：絕對淀粉得率，%；w：原料中淀粉的質量分數，%。

本文采用濕磨法結合酸漿法提取路線，考察NaOH溶液的體積（200、400、600、800、1000 mL）、浸泡時間（8、12、16、20、24 h）、乙醇的體積（40、60、80、100、120 mL）、振蕩時間（20、40、60、80、100 min）以及振蕩轉速（40、80、120、160、200 r/min）五個因素對豇豆淀粉提取率的影響，實驗中均選取中值為固定因素水平，所有實驗均進行三次重復。

1.2.3 響應面優化設計 使用Design-expert8.2軟件，采用Box-Behnken（BBD）設計方法，根據單因素實驗結果，選取五因素三水平實驗設計方案優化淀粉提取工藝。Box-Behnken設計響應面試驗設計因素水平及編碼見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.4 豇豆淀粉組分含量測定 水分含量參照AOAC（1997）標準方法進行測定；蛋白質含量參照GB/T 5009.5-2016進行測定；脂肪含量參照GB/T 5009.6-2016進行測定；灰分含量參照GB/T 5009.4-2016進行測定；粗纖維含量參照GB/T 5515-2008進行測定；淀粉含量使用Total Starch Assay Kit試劑盒進行測定。

1.2.5 淀粉pH、溶解度和膨潤力的測定 稱取一定量的淀粉樣品，配制樣品干基含量5%（w/w）的淀粉乳，用FiveEasy Plus FE28型pH計測量樣品pH。

稱取質量記為W的淀粉樣品，配制樣品干基含量5%（w/w）的淀粉乳，30 ℃攪拌30 min后，至于離心管中，3000×g離心15 min。取上清液在蒸發皿中100 ℃蒸干后，放入105 ℃烘箱中烘干稱重，記為W1；取下層稱重為W2。溶解度（SI）與膨潤力（SP）計算公式如下：

1.2.6 淀粉顆粒表面形貌的測定 使用Verios G4 UC場發射掃描電子顯微鏡觀察淀粉的顆粒形態。取適量淀粉干基樣品黏附于樣品臺的雙面導電膠上，在離子濺射裝置中噴金后，使用電子顯微鏡對淀粉顆粒進行成像觀察，選擇代表性顆粒拍攝成像。

1.2.7 淀粉顆粒粒徑分布的測定 使用激光粒徑分析儀測定淀粉樣品顆粒的粒度分布。在室溫下用乙醇分散樣品，并將樣品超聲處理5 min，以避免結塊的形成[11]。

1.2.8 淀粉傅里葉變換紅外光譜（FTIR）測定 使用傅里葉變換紅外光譜儀測定淀粉的紅外光譜。采用KBr壓片法，將預平衡水分的樣品以一定比例（1%，w/w）加入KBr粉末中充分研磨混勻后壓片，置于紅外光譜儀中進行掃描。測試條件為分辨率4 cm?1，空氣為空白，掃描64次。利用OPUS 6.5軟件對譜圖進行基線校正和歸一化處理，所有測量均一式三份。

1.2.9 淀粉結晶結構的測定 使用Smart Lab X射線衍射儀（XRD）進行結晶結構分析。將待測樣品置于飽和NaCl條件下平衡7 d，取一定量的待測樣品平鋪于樣品池中制樣。采用單色Cu-Kα射線，測試條件為：掃描區域2θ=4°~30°，掃描步長0.02°，掃描速度4°/min，掃描方式為連續，獲得衍射圖譜。使用軟件Origin 2018，定量計算衍射圖下結晶面積與總面積之間的比率表征淀粉的相對結晶度[12]。

1.2.10 淀粉熱力學性質的測定 使用Q600型熱重分析儀和DSC250型差示掃描量熱儀測定樣品的熱力學性質。將樣品裝入坩鍋中，以10 ℃/min的速率從30 ℃加熱到600 ℃，在氮氣流速為50 mL/min的條件下進行熱重分析。稱取樣品約2 mg，用超純水配制20%（w/w）的混合液，直接將懸浮液放入鋁鍋中進行分析。差示掃描量熱法分析程序為在氮氣下以5 ℃/min的速率從30 ℃加熱到120 ℃。用軟件TRIOS5.1計算起始溫度（To）、峰值溫度（Tp）和結束溫度（Tc）以及糊化焓（ΔH）。

1.3 數據處理

實驗數據為至少三次重復測量的平均值和標準偏差，采用IBM SPSS Statistics 23.0軟件進行統計分析（P<0.05），采用Origin 9.5軟件進行分析作圖。

2 結果與分析

2.1 豇豆淀粉提取的單因素實驗結果

圖2 分別展示了各因素對豇豆淀粉提取率的影響。由圖2A能夠看出，NaOH溶液體積在200~1000 mL的范圍內，豇豆淀粉的提取率隨著NaOH溶液體積的增大呈現先上升后下降的趨勢，在400 mL出現最大值，但與200、600 mL時沒有顯著差異，在800 mL之后出現了明顯的下降趨勢；由圖2B能夠看出，在8~24 h范圍內，提取率隨著時間的增加呈現先上升再下降的趨勢，在16 h達到最大值。出現這一現象的原因，推測可能是因為隨著溶液的增多與浸泡時間的延長，豇豆在浸泡過程中淀粉與蛋白質等復合結構逐漸解開，使淀粉更易提取，直到豇豆結構遭到較大破壞，使淀粉溶出流失等因素導致的[13]。因此，選取NaOH溶液的體積400 mL與浸泡時間16 h為最佳值進行響應面優化。

由圖2C能夠看出，在乙醇體積為40~120 mL范圍內，提取率呈現上升后下降的趨勢，在80 mL處達到最大值，之后出現小幅下降并波動；由圖2D可以看出，在振蕩時間20~100 min范圍內，提取率的影響呈現上升后下降的趨勢，在60 min左右達到最大值；由圖2E可以看出，在振蕩轉速40~200 r/min范圍內，提取率呈現先上升后逐漸保持平穩的趨勢，在160 r/min附近達到最大值。出現這一結果的原因，推測可能是因為乙醇振蕩過程中使淀粉中的蛋白質變性，蛋白質表層失去水化層相互聚集而沉淀，但當條件在一定程度時可能會導致蛋白聚沉時包裹一部分淀粉造成損失[4]。綜合考慮提取率結果與經濟性后，選取乙醇的體積80 mL、振蕩時間60 min與振蕩轉速160 r/min為最佳值進行響應面優化。

圖2 各單因素對豇豆淀粉提取率的影響Fig.2 Effect of single factor on extraction rate of cowpea starch

2.2 豇豆淀粉提取的響應面優化結果

根據設計的Box-Behnken試驗進行實驗，結果如表2所示。采用Design-Expert軟件對結果進行響應面分析，得到回歸方程：

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

提取率（%）=43.85?4.64A+9.05B+1.28C+2.55D+7.29E?0.19AB?0.078AC?1.38AD?2.06AE?0.65BC+2.05BD+2.56BE+1.26CD+1.97CE+2.33DE?1.31A2?0.41B2+0.73C2?3.56D2?1.96E2

根據實驗結果進行方差分析，如表3所示，此擬合模型中F值為473.241，P<0.0001，為極顯著水平，決定系數R2為0.9929，調整后R2為0.9872，失擬項不顯著，這說明該回歸方程對試驗擬合程度良好。對回歸方程的顯著性進行檢驗分析，表明在提取過程中，一次項NaOH溶液的體積A、浸泡時間B、乙醇的體積C、振蕩轉速D、振蕩時間E，交互項AD、AE、BD、BE、CD、CE、DE，以及二次項A2、C2、D2、E2對響應值的影響極顯著（P<0.001），BC、B2對響應值的影響顯著（P<0.05），其它因素對響應值的影響不顯著。這些結果表明此模型對豇豆淀粉提取的分析和預測是可靠的。

表3 響應面二次回歸方程模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

根據所擬合的回歸方程，考察交互項對淀粉提取率的影響，經Design-Expert軟件分析，根據模型求響應面的最大極值點，根據實驗條件實際進行調整，最佳提取條件為：NaOH溶液的體積420 mL、浸泡時間17 h、乙醇的體積74 mL、振蕩轉速167 r/min、振蕩時間70 min，此條件下最大提取率為62.13%。以模型預測最佳提取條件進行實驗驗證，得到提取率61.69%±0.07%，與預測值十分接近，表明該模型具有一定的實踐價值，可行度較好。但值得注意的是，此方法得到的提取率并不突出，推測是因為豇豆中蛋白質、纖維素等含量較高，致使淀粉較難提取等因素導致，實驗還有一定的改進空間，有待于進一步探索研究酶輔助等方法進一步提取純化。

2.3 豇豆及豇豆淀粉的成分組成與性質

豇豆及豇豆淀粉的化學成分和直鏈淀粉含量如表4所示。淀粉的質量可以通過純度來判斷，而純度又取決于灰分、脂肪、蛋白質含量等[14]。結果表明，豇豆淀粉的灰分及蛋白質等含量較低，總淀粉含量較高，表明所提取的豇豆淀粉質量合格，滿足后續研究需求。從豆科植物中提取淀粉是困難的，因為水合纖維和淀粉同時存在于細胞壁中，而且植物蛋白含量很高，這可能是豇豆淀粉比其他植物淀粉含有更多雜質的原因[15]。本文所得豇豆淀粉的直鏈淀粉含量在18.72%~49.50%之間，平均值為37.52%，直鏈淀粉含量高于國內報道的其他品種，但與印度和尼日利亞的品種相似[16?17]。

表4 豇豆及豇豆淀粉的成分組成與性質Table 4 Composition and properties of cowpea and cowpea starch

豇豆淀粉相對較低的溶解度和溶脹度，證實了豇豆顆粒結構較強，相對結晶度較高，直鏈淀粉含量較高。對淀粉的糊化、回生、溶脹等功能和理化性質影響極大，應引起重視。

2.4 豇豆淀粉顆粒場發射掃描電子顯微鏡觀察結果

豇豆淀粉的掃描電鏡照片如圖3所示。豇豆淀粉粒呈球形或橢球形，有少量不規則顆粒。豇豆淀粉表面光滑，沒有裂紋或針孔，與其他豆類淀粉顆粒一樣，有少量的團聚結構[18]。顯微照片顯示，一小部分豇豆淀粉顆粒表面有輕微損傷，考慮是提取方法的影響，其數量少，損傷相對較小，對后續研究結果不會有明顯影響。在豇豆淀粉中觀察到與Kaptso等[19]報道的相似的少量顆粒聚集，這可能是由于干燥方法導致顆粒表面的輕微糊化，或者可能歸因于粗蛋白殘留物的存在而導致顆粒形成聚集體。顯微照片顯示提取的淀粉中含有少量的蛋白質和纖維基質，這與化學分析結果一致，說明淀粉提取工藝是可行的。

圖3 豇豆淀粉掃描電鏡照片Fig.3 Scanning electron microscope photos of cowpea starch

淀粉的顆粒結構對其性質影響很大。根據來源的不同，豇豆淀粉呈現出橢圓形、腎形、不規則球形等多種結構。根據報道，豇豆淀粉顆粒通常被發現是光滑的，沒有孔洞或裂縫[20]。這可能是豇豆淀粉具有優異的熱穩定性和功能性的原因，也很可能是其具有較強抗消化能力的原因。因為豇豆淀粉顆粒結構堅固，沒有裂縫，可以推測豇豆淀粉的糊化溫度相對較高，膨脹力較低。

2.5 豇豆淀粉顆粒粒徑分布

圖4 描述了豇豆淀粉的粒徑分布結果，總體呈現一個中等尺寸的顆粒尺寸分布[21]。豇豆淀粉呈現了一個近似于雙峰的分布形態，主峰位于10.5 μm附近，在12.5 μm附近有一個較大的肩峰。據報道，豇豆淀粉的顆粒大小為1.89~48.60 μm，本文中樣品符合文獻報道的粒徑分布[22]。然而，之前的研究大多報道了豇豆淀粉呈單峰粒度分布。在提取過程中的NaOH溶液浸泡過程，可能會使部分淀粉被浸出，導致一定的淀粉顆粒聚集，這可能是本文中豇豆淀粉樣品呈近似雙峰分布的原因，這一現象在之前的電鏡照片中也有所體現。同時淀粉粒度分布的差異也受谷物來源、種植環境條件等多種因素的影響[23]。

圖4 豇豆淀粉粒徑分布圖Fig.4 Particle size distribution of cowpea starch

2.6 豇豆淀粉的FTIR譜圖分析

豇豆淀粉的FTIR圖譜如圖5所示，呈現典型的淀粉類多糖特征。淀粉在3330 cm?1左右的強吸收峰被認為歸屬于自由羥基的伸縮振動，約2930 cm?1處的吸收峰被認為是主要由亞甲基C-H伸縮貢獻。在925 cm?1處的吸收峰被認為是C-O-C基團的α-1,4糖苷鍵和C-O的伸縮振動。它可以表征淀粉的親水性，如溶解度和溶脹度。在這個波數，豇豆淀粉的吸收峰相對較弱，這可以表明豇豆淀粉相對較低的溶解度和溶脹度，本文的相關研究也證實了這一點。1635和1000 cm?1左右的吸收峰分別為C-O和C-O伸縮振動，1050 cm?1左右的吸收峰與淀粉的晶體結構有關。這些譜帶上的較強峰可以證明豇豆淀粉具有較強的結晶結構[24?27]。

圖5 豇豆淀粉FTIR譜圖Fig.5 FTIR spectrum of cowpea starch

2.7 豇豆淀粉的結晶結構分析

X射線衍射圖譜的研究為淀粉顆粒的有序結構提供了重要的參考。采用X射線衍射儀對豇豆淀粉顆粒進行了測定，并計算了淀粉顆粒的相對結晶度，結果如圖6與表5所示。豇豆淀粉的衍射圖在15°、17°、18°和23°處有較強的峰，在5.6°和20°處有微弱但可分辨的峰，表明豇豆淀粉具有典型的C型晶體結構[21]。根據所得譜圖計算，豇豆淀粉樣品的相對結晶度為31.57%±0.23%，與Oyeyinka等[5]觀察到的10.57%~32.70%的范圍一致。較高的結晶度與前期FTIR的研究結果相印證。

圖6 豇豆淀粉XRD譜圖Fig.6 XRD spectrum of cowpea starch

表5 豇豆淀粉熱力學性質表Table 5 Thermodynamic properties of cowpea starch

一般來說，淀粉有三種類型的多晶型（A、B和C），這取決于淀粉的來源和淀粉晶體片層的排列[28]。A型和B型的不同之處在于水化程度和支鏈中雙螺旋的堆積排列。據報道，與具有更多水合核心的B型多晶型相比，A型多晶型的水化程度較低。豆類淀粉以C型為主，被認為是A型和B型的混合體。C型通常被分為三種類型：CA型、CB型和CC型（典型的C型），分類取決于圖譜性質更類似于A型或B型。C型明顯更為復雜，其理化和功能性質在很大程度上取決于A型和B型的比例。一般來說，C型結晶度的淀粉更耐消化，熱力學性質穩定[29]。

根據報道，大多數豇豆淀粉是C型淀粉，特別是CC型淀粉，然而，一些作者發現，A型結晶淀粉也存在于豇豆中。Ratnaningsih等[8]將豇豆淀粉歸類為CA型，因為它更接近A型結晶，這表明其中A型淀粉比B型淀粉含量占優勢。然而，本文中豇豆淀粉樣品幾乎沒有明顯的趨向，而是具有典型的C型結構（CC型）。淀粉結晶型的差異可能受來源作物基因型、生長條件、生長位置等因素影響。

淀粉的相對結晶度受到支鏈淀粉鏈的含量和長度、結晶區中雙螺旋的取向以及雙螺旋之間的相互作用程度等因素影響。這在一定程度上表明，直鏈淀粉含量越高，淀粉的相對結晶度越低，無定形區域所占比例越大，即淀粉中的結晶結構主要由支鏈淀粉貢獻。然而本文中豇豆淀粉樣品具有較高的直鏈淀粉含量的同時，也具有較高的相對結晶度。這可能是因為直鏈淀粉可以位于支鏈淀粉分子之間，支鏈淀粉分子在支鏈淀粉分子的結晶區具有很高的有序度。在其他類型的淀粉中也發現了這種現象，如蠟質淀粉和木薯淀粉[30?31]。

2.8 豇豆淀粉的熱力學性質的測定

豇豆淀粉樣品的熱重分析（TGA）和差示掃描量熱分析（DSC）的結果如表5所示。TGA結果顯示了典型的淀粉類多糖的三段失重特征。第一階段失重峰在45~80 ℃左右，被普遍認為是淀粉結合水的損失[32]，第二階段失重峰在300~340 ℃左右，被認為是碳鏈分解的結果[33]。DSC結果表明，淀粉樣品出現一個吸熱峰，這代表著淀粉的糊化過程[34]。其起始糊化溫度（To）為（73.86±0.14）℃，峰值溫度（Tp）為（80.59±0.24）℃，結束溫度（Tc）為（88.53±0.32）℃。淀粉的糊化焓（ΔH）被認為是支鏈淀粉晶體熔融的標志，豇豆的淀粉糊化溫度范圍（ΔT）也較寬，這可能與其較高的相對結晶度有關，這些結果與早先報道的豇豆淀粉的熱性質一致，也與前期研究中電鏡、XRD等結果一致。

淀粉的糊化溫度受許多參數的影響，如直鏈淀粉含量、相對結晶度、淀粉結構等。較高的糊化溫度、較寬的糊化范圍和較大的糊化焓表明豇豆淀粉具有較好的抗糊化性能，這可能是由于淀粉顆粒中的晶體結構完整而牢固，支鏈淀粉與直鏈淀粉鏈之間的結合力較強，其相對結晶度較高等[35]。豇豆淀粉擁有較為優秀的抗糊化性質，這表明豇豆淀粉在食品工業中具有廣闊的應用前景。

3 結論

本研究采用濕磨法工藝，在單因素實驗的基礎上，采用五因素三水平的響應面曲面分析法確定長豇豆淀粉提取工藝的的最佳參數，并對長豇豆淀粉的精細結構與物化性質進行了一定的研究。實驗結果得到豇豆淀粉最佳提取工藝：NaOH溶液420 mL、浸泡時間17 h、乙醇體積74 mL、振蕩轉速167 r/min、振蕩時間70 min，此條件下理論提取率為62.13%，實際提取率為61.69%±0.07%。

提取的豇豆淀粉灰分含量為0.17%，蛋白質含量0.87%，脂質含量0.25%，纖維素1.59%，溶解度0.73%，溶脹度1.85 g/g；掃描電鏡圖像表明，豇豆淀粉顆粒呈球型或橢球形，粒徑大多分布在9~13 μm范圍內；傅里葉變換紅外光譜與X射線衍射分析分析表明，豇豆淀粉具有較強的結晶結構，具有較高的相對結晶度，呈現典型C型結晶淀粉形態；熱力學分析表明，起始糊化溫度（To）為73.86 ℃，峰值溫度（Tp）為80.59 ℃，結束溫度（Tc）為88.53 ℃，豇豆淀粉具有較強的抗糊化性質。

實驗結果表明，豇豆淀粉具有緊密的結構與獨特的熱力學性質。較高的糊化溫度與較低的溶脹度以及較高的直鏈淀粉含量表明豇豆淀粉在食品改良劑等領域中有著良好的發展潛力。本實驗結果為豇豆淀粉的進一步分離純化和形態結構與物化性質的分析提供了參考，為豇豆淀粉作為特定領域食品專用產品加工及其他相關領域的產品開發與應用等提供理論指導與數據支撐。