超聲微波協同制備粗毛纖孔菌多糖及體外降脂作用的研究

趙有偉，李德海

（東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）

隨著生活質量的提高，人們日常生活中對高脂、高糖、高能量飲食的攝入增加，導致高血脂癥患病人群數量增加，高血脂癥已成為世界關注的重點問題[1]。預防與治療高脂血癥的方法有運動鍛煉、控制飲食和藥物治療等方式，其中藥物治療方式效果雖好，但是有毒副作用[2]。有研究表明天然產物中含有許多降血脂的物質，從天然產物中開發降血脂的物質成為當今研究熱點[3]。

粗毛纖孔菌Inonotus hispidus（Bull.）Pat.，又名粗毛黃褐孔菌，是一種非常珍貴的藥用真菌[4]。粗毛纖孔菌作為一種藥用真菌，具有抗腫瘤[5]、抑菌[6]、抗氧化[7]、降血脂[8]、提高免疫力[9]等生物活性。目前已經從粗毛纖孔菌中分離得到多種具有生物活性的化合物，包括多糖類[10]、三萜類[11]和酚類[12]等。多糖作為粗毛纖孔菌中的主要活性成分，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等作用[13?14]。但提取方法對有效活性成分的提取效果以及活性的影響很大[15]。張倩等[16]研究熱水浸提和超聲微波協同提取對枸杞多糖的提取率和抗氧化活性影響，結果表明超聲微波協同法得到的枸杞多糖提取率顯著高于熱水浸提法，且超聲微波協同法得到的多糖對自由基的清除能力比熱水浸提法更好。蘇平等[17]研究四種不同輔助提取方法對黃秋葵花多糖的提取率和抗氧化活性的影響，四種方法對比發現酶法提取的黃秋葵花多糖提取率最高，四種方法提取的多糖抗氧化活性效果不同，超聲輔助提取的多糖表現出更強的抗氧化活性。馬舒偉等[18]研究不同方法對玄參多糖單糖組分和抗氧化活性的影響，不同方法提取的玄參多糖對比發現，酶輔助提取法提取的玄參多糖的純度最高，體外抗氧化活性最強。

超聲微波協同輔助提取法充分利用了超聲波震動的空化作用與微波的高能效應和熱效應，將超聲微波相結合，既能縮短提取時間，又可以提高提取效率，從而實現高效快速的處理樣品[19]，有學者采用微波超聲組合提取猴頭菇多糖與熱水提取法、超聲波提取法和微波提取法相比，發現微波超聲聯用組合具有節省時間和多糖浸出率高等優點[20]。因此為提高粗毛纖孔菌多糖的提取率，本文采用Box-Behnken試驗設計研究了超聲微波協同制備粗毛纖孔菌多糖的工藝，并與微波輔助提取法和熱水提取法對比分析了粗毛纖孔菌多糖提取率及體外膽酸鹽結合能力，以期為把粗毛纖孔菌多糖開發成為一種降脂功能性食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗毛纖孔菌子實體 于2020年9月采自東北林業大學林場；葡萄糖、濃硫酸、苯酚 國產分析純；甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c、胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（1:250） 上海源葉生物生物科技有限公司。

Scientz-IIDM型微波光波超聲波萃取儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；FW100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；722s型紫外分光光度計 上海第三分析儀器廠；RE-52型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器公司；SHB-Ⅲ型循環水真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；GL10048型萬分之分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司；TDL40BW型臺式離心機 上海星科科學儀器有限公司；HH-4型電熱恒溫水槽 上海力辰儀器科技有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料處理 將采摘的新鮮粗毛纖孔菌子實體于烘箱中60 ℃烘干，高速粉碎機粉碎，過60目篩，備用。

1.2.2 超聲微波協同制備粗毛纖孔菌子實體多糖工藝

1.2.2.1 單因素實驗 準確稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，加入一定體積的蒸餾水，充分攪拌后放置微波光波超聲波萃取儀中，固定實驗參數料液比1:30 g:mL，超聲時間30 min，超聲功率200 W，微波時間30 s，微波功率300 W，分別考察料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g:mL），超聲時間（10、20、30、40、50、60 min）、超聲功率（100、200、300、400、500 W）、微波時間（10、20、30、40、50、60 s）、微波功率（100、200、300、400、500、600 W）對超聲微波輔助提取粗毛纖孔菌多糖提取率的影響，將制備得到的多糖提取液在4000 r/min離心15 min，上清液即為粗毛纖孔菌子實體多糖溶液，殘渣按上述步驟復提兩次，合并提取液。在旋轉蒸發儀上60 ℃旋轉蒸發至原體積的1/4，冷卻后測多糖含量。得出五個單因素對IHP提取率的影響，最終根據單因素實驗結果確定響應面試驗的因素和水平。

1.2.2.2 響應面設計 根據單因素的實驗結果，使用Design-Expert8.0軟件進行響應面試驗設計，因素水平表見表1。根據響應面試驗結果，建立數學模型，確定IHP的最佳提取條件。

表1 響應面設計因素水平及編碼Table 1 Factors, levels and coding for response surface design

1.2.3 不同提取方法對粗毛纖孔菌多糖提取率的影響將優化后的超聲微波輔助法對IHP的提取率與熱水浸提法和超聲輔助法進行對比。超聲微波輔助提取法：稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸餾水，充分攪拌后，置于放置微波光波超聲波萃取儀中，設定超聲時間51 min，超聲功率200 W，微波時間50 s，微波功率500 W進行提取，離心取上清液，測多糖含量。熱水浸提法和超聲輔助法采用預實驗優化得到的工藝條件。熱水浸提法：稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸餾水，充分攪拌后，60 ℃水浴浸提3 h，提取結束后，離心取上清液，測多糖含量。超聲輔助法：稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸餾水，充分攪拌后，置于放置微波光波超聲波萃取儀中，設置超聲功率200 W，超聲時間1 h，提取結束后，離心取上清液，測多糖含量。

1.2.4 粗毛纖孔菌多糖含量的測定

1.2.4.1 葡萄糖標準曲線的制作 采用苯酚-硫酸法測定糖含量[21]準確稱取經真空干燥恒重的葡萄糖40 mg，于500 mL容量瓶中定容配制成80 μg/mL的葡萄糖標準液，取2.0 mL蒸餾水為空白樣，用移液槍依次吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖標準液于具塞試管，各管補加蒸餾水至2.0 mL，加入6%苯酚1 mL，98%濃硫酸5 mL，靜置10 min后振蕩混勻，室溫下靜置20 min后，充分反應，于490 nm下測定OD值，以葡萄糖含量（μg/mL）為橫坐標，OD值為縱坐標作葡萄糖標準曲線。得到的線性回歸方程y=0.0146x+0.3004，R2=0.9931，可以用于計算多糖含量。

1.2.4.2 多糖含量的測定 準確吸取2 mL已提取好的IHP溶液，加入6%苯酚1.0 mL和98%濃硫酸5.0 mL，靜置10 min后振蕩混勻，在室溫下放置20 min，于490 nm下測定OD值。若測得樣品多糖濃度不在測量范圍內，應當稀釋再次測量。粗毛纖孔菌多糖的提取率為提取液中的多糖與總多糖的比值，在預實驗中，采用熱水法反復多次提取確定了粗毛纖孔菌子實體多糖含量為16.4%。提取率計算公式為：

式中：C為根據標準曲線計算得到的粗毛纖孔菌水提液液所含多糖的質量濃度，μg/mL；V為粗毛纖孔菌水提液總體積，mL；N為溶液最終的稀釋倍數；k為粗毛纖孔菌子實體粉末的重量，g；m為1 g粗毛纖孔菌子實體粉末總多糖含量，%。

1.2.5 體外降脂實驗

1.2.5.1 膽酸鹽標準曲線的繪制 膽酸鹽測定方法參照文獻[22]分別取不同濃度的膽酸鹽標準溶液（甘氨膽酸鈉0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 mmol/L，牛磺膽酸鈉0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L），2 mL于具塞試管中，向每管標準溶液中依次加入6 mL質量分數60%的H2SO4，70 ℃恒溫水浴鍋中水浴20 min，取出后進行冰浴5 min，在387 nm處測定吸光度，分別作兩種膽酸鹽標準曲線，計算回歸方程，牛黃膽酸鈉的回歸方程為y=2.8591x?0.0176，R2=0.9957，可以用于計算牛磺膽酸鈉含量。甘氨膽酸鈉的回歸方程為y=1.5012x+0.0536，R2=0.9957，可以用于計算甘氨膽酸鈉含量。

1.2.5.2 粗毛纖孔菌多糖膽酸鹽結合能力的測定粗毛纖孔菌多糖提取液以1:3的比例加入95%乙醇，4 ℃醇沉24 h，離心，去除上清液，沉淀即為粗毛纖孔菌粗多糖，將粗多糖用蒸餾水配制成20 mg/mL多糖溶液分別吸取1 mL粗毛纖孔菌粗多糖溶液于100 mL具塞三角瓶中，加入1 mL10 mg/mL胃蛋白酶，3 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，在37 ℃恒溫振蕩，模擬胃環境（pH為1.5）消化1 h；以0.1 mol/L的NaOH溶液調節溶液pH至6.3，再加入4 mL10 mg/mL胰蛋白酶，模擬腸道環境進行消化1 h，加入4 mL 1 mmol/L膽酸鹽消化1 h，4000 r/min離心20 min，取上清液，比色測定膽酸鹽含量，平行3次實驗。甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉結合率按下式計算。

式中：c1為甘氨膽酸鈉加入量，μmol，c2為甘氨膽酸鈉剩余量，μmol，c3為牛磺膽酸鈉加入量，μmol，c4為?；悄懰徕c剩余量，μmol。

1.3 數據處理

實驗重復三次，試驗中的數據運用SPSS17.0軟件進行方差分析（analysis of variance，ANOVA）單因素方差分析，數據以表示，組間做t檢驗，P<0.05則表示有顯著性差異，有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對IHP提取率的影響 由圖1可知，IHP提取率隨料液比的增加而提高，其中當料液比在小于1:30 g:mL時，IHP提取率隨料液比比例的增加而顯著提高（P<0.05），當料液比大于1:30 g:mL時，IHP提取率增加不顯著（P>0.05）。當料液比小于1:30 g:mL時，由于提取溶劑的量過少，IHP提取液中多糖處于飽和狀態，粗毛纖孔菌中的多糖無法進一步溶出，此時隨著提取溶劑量的增加，多糖不斷溶出，提取率也在增加。但是當料液比大于1:30 g:mL時，粗毛纖孔菌中多糖已經大量溶出至提取溶劑中，而提取溶劑中多糖也沒有達到飽和狀態，因此即使增加提取溶劑用量，IHP提取率變化不大[23]，差異性不顯著（P>0.05），所以選取最佳料液比為1:30 g:mL。

圖1 料液比對IHP提取率的影響Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction rate of IHP

2.1.2 超聲時間對IHP提取率的影響 由圖2可知，IHP的提取率隨超聲波作用時間的增加而增加，主要是由于超聲波作用時間增加，粗毛纖孔菌細胞破裂，多糖不斷溶出，在50 min時達到最大值，60 min多糖的提取率略微降低，可能原因是超聲波作用時間過長對多糖的結構會產生影響，會導致多糖降解，影響多糖的生物活性[24?25]。選取最優超聲時間為50 min。

圖2 超聲時間對IHP提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasound time on the extraction rate of IHP

2.1.3 超聲功率對IHP提取率的影響 由圖3可知，隨著超聲功率的增大，IHP的提取率先增大后減小在200 W處達到最大值，300 W處有下降趨勢，但是差異不顯著（P<0.05），300 W之后開始降低，可能是在較大的超聲功率下，超聲波的振動作用、空化效應和粉碎作用過強，從而導致多糖結構受到破壞從而損失，導致多糖的提取率降低[26]。陳宇航等[27]研究超聲微波協同提取豆渣水溶性多糖發現，超聲功率超過300 W，多糖分子在較強的機械作用下發生斷裂，從而引起提取率的急劇下降。因此選擇超聲功率為200 W作為最佳超聲功率。

圖3 超聲功率對IHP提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of IHP

2.1.4 微波功率對IHP提取率的影響 由圖4可知，隨微波功率的增加，IHP的提取率增加，微波功率為100~300 W時，多糖的提取率增加顯著（P<0.05），可能是由于微波功率增加，微波作用的強度增大，對細胞的細胞壁和細胞膜產生破壞作用，促進多糖的釋放，從而提高多糖提取率[28]。微波功率為300~600 W時，多糖的提取率有所增加，變化不顯著（P>0.05），趨于平穩，主要原因為在微波功率300 W時，原料中的多糖已經被最大限度提出來，因此多糖提取率不會繼續升高，與最大值基本保持一致。最佳微波功率選取范圍為200~600 W。

圖4 微波功率對IHP提取率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the extraction rate of IHP

2.1.5 微波時間對IHP提取率的影響 由圖5可知，IHP的提取率隨微波作用時間的增加而增加，在微波時間為50 s時，提取率達到最大值，60 s時多糖的提取率略微下降，可能是由于微波作用的時間過長，導致多糖發生熱降解，導致提取率下降[29]?？紤]到微波作用時間為60 s時，多糖的提取率與50 s時多糖的提取率相比，差異性不顯著（P>0.05），且微波作用時間過長可能對多糖活性有影響，因此選取50 s作為最佳微波時間。

圖5 微波時間對IHP提取率的影響Fig.5 Effect of microwave time on the extraction rate of IHP

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面優化試驗設計及結果 綜合單因素實驗結果，固定超聲功率200 W，選取料液比、超聲時間、微波時間和微波功率四個影響因素作為自變量，多糖提取率作為因變量，根據Box-Behnken的原理，使用Design Expert8.0軟件進行響應面分析。實驗共29個試驗點，包括5個中心點。表2是響應面優化實驗的設計方案及結果。

表2 Box-Behnken試驗設計和結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 二次回歸模型擬合及模型分析 通過29組關于多糖提取率的響應面實驗得到的二次多元回歸模型為：

對該回歸方程的分析見表3。由表3可知，模型的F=37.59，P<0.0001，表明該模型達到極顯著水平，且失擬項P=0.1394>0.05，表明該模型擬合良好，具有統計學意義，該模型離散系數CV=1.87%，RPred2=0.8630，RAdj2=0.9482。在合理范圍內，Adeq Precision=24.653，表明可以用來預測超聲微波協同萃取IHP的提取率。模型中A、C、D、BD、A2、B2、D2對IHP提取率的影響極顯著（P<0.01），B、BC和C2影響顯著（P<0.05），而交互項AB、AC、AD和CD影響不顯著，表明各因素對提取率的影響并不是簡單的線性關系。從一次項來看，根據方差分析中的F值可判斷各個因素對提取率的影響大小為D>A>C>B，即料液比>超聲時間>微波功率>微波時間。

表3 Box-Behnken試驗方差分析Table 3 Box-Behnken experiment variance analysis

2.2.3 IHP提取最優條件的確定與驗證 根據所建立的二次回歸模型，使用Design-Expert8.06進行參數優化分析，得到超聲波微波協同提取IHP的最佳工藝條件為：超聲時間51.45 min，微波時間50 s，微波功率523.89 W，料液比1:33.21 g:mL，在此條件下多糖的提取率可達85.92%。對軟件得到的最佳工藝參數進行調整：超聲時間51 min，微波時間50 s，微波功率500 W，料液比1:33 g:mL，在此條件下進行三次平行實驗，測得IHP的提取率平均為85.61%±1.32%，與模型的預測值較為接近，表明該回歸方程可以很好地反映IHP的提取率。

2.3 提取方法對IHP制備效果的比較分析

優化后的超聲微波協同提取法與熱水浸提法、超聲輔助法對粗毛纖孔菌多糖的提取率對比，結果如圖6所示。

由圖6可知，三種提取方法中，超聲微波輔助法提取率最高，為85.05%，其次是超聲輔助法68.11%，提取率最低的是熱水浸提法62.36%，超聲波微波輔助提取法相對于超聲波輔助法，提取率增加24.87%，相對于熱水提取法，提取率增加36.38%。超聲輔助法可以明顯提高IHP的提取率，這主要是由于超聲波的機械效應和空化效應能有效的破碎粗毛纖孔菌的細胞壁，使得多糖快速溶出，從而提高IHP的提取率[30]。超聲微波輔助法提取率明顯高于超聲輔助提取法，可能是由于超聲波和微波協同作用，對粗毛纖孔菌細胞的破碎作用增加，使多糖的溶出率提高，且超聲微波協同作用可以使微波的傳熱均勻，彌補超聲波產熱不足的問題，從而提高IHP的提取率[31]。實驗結果表明，超聲微波輔助提取法可以明顯提高IHP的提取率。

圖6 不同提取方法對IHP提取率的影響Fig.6 Effect of different extraction methods on the extraction rate of IHP

2.4 提取方法對IHP體外膽酸鹽結合的影響

由圖7可知，三種不同方法提取的IHP對甘氨膽酸鈉均有一定的結合能力，且隨著質量濃度的增加，結合率也逐漸升高，呈質量濃度依賴性。但是三種方法提取的IHP在相同質量濃度的條件下對甘氨膽酸鈉的結合能力存在顯著差異（P<0.05），可以看出超聲微波輔助提取的IHP的結合率明顯高于其他兩種方式提取的多糖。當質量濃度為20 mg/mL時，三種方式提取IHP對甘氨膽酸鈉的結合率均達到最大值，分別是30.93%、27.32%和23.16%，其中超聲微波輔助法IHP結合率最高，其次是超聲輔助提取，熱水浸提得到的多糖結合率最低。說明超聲微波輔助法提取的IHP與甘氨膽酸鈉結合能力強，推測超聲微波輔助法提取的IHP降血脂效果更好。

圖7 三種不同方式提取多糖結合甘氨膽酸鈉能力Fig.7 Binding ability of polysaccharides extracted in three different ways to sodium glycocholate

由圖8可知，三種不同方式提取的IHP均能結合牛磺膽酸鈉，牛磺膽酸鈉的結合率隨IHP的質量濃度的增加而增加，呈一定的劑量-效應關系。從圖中可以看出，超聲微波輔助提取IHP對牛磺膽酸鈉的結合率高于其他兩種提取方式，三種方式提取多糖質量濃度為20 mg/mL時，對?；悄懰徕c的結合率達到最高，分別是超聲微波輔助提取32.13%、超聲波輔助28.05%、熱水浸提24.82%。

圖8 三種不同方式提取多糖結合牛黃膽酸鈉能力Fig.8 Binding ability of polysaccharides extracted in three different ways to sodium taurocholate

三種提取方式制備的粗毛纖孔菌多糖對兩種膽酸鹽的結合能力顯示，超聲波微波輔助提取的多糖對?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結合率均高于其余兩種方式，其次是超聲波輔助提取，而熱水浸提的粗毛纖孔菌多糖對兩種膽酸鹽的結合能力最低，這可能是因為，超聲波微波輔助提取法中，由于超聲波和微波的作用使得粗毛纖孔菌多糖的官能團暴露出來，從而提高粗毛纖孔菌多糖對兩種膽酸鹽的結合量，使得粗毛纖孔菌多糖的降脂效果增加[32]。三種方式提取的IHP對?；悄懰徕c的結合能力均強于甘氨膽酸鈉，這可能是因為?；悄懰徕c側鏈末端的磺酸基的極性更大比甘氨膽酸鈉側鏈末端的羧基解離性更強[33]，更加易于與IHP結合。

3 結論

在單因素實驗基礎上，通過響應面對粗毛纖孔菌子實體多糖超聲微波協同提取工藝進行優化，對軟件得到的最佳工藝參數進行調整：超聲時間51 min，微波時間50 s，微波功率500 W，料液比1:33 g:mL，在此條件下IHP的提取率為85.61%，與模型的預測值較為接近。與熱水浸提法和超聲輔助法相比，提取率分別增加了24.87%、36.83%。體外膽酸鹽結合實驗表明超聲微波輔助提取的粗毛纖孔菌多糖對甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉的結合率優于熱水浸提法和超聲波輔助法，呈劑量依賴性，對?；悄懰徕c的結合率高于甘氨膽酸鈉。本研究結果表明超聲微波協同提取可增加IHP的提取率促進IHP的膽酸鹽結合能力，為粗毛纖孔菌多糖開發成為一種降血脂功能食品提供理論依據，但其體內降脂的具體機制還需進一步研究探討。