輔助能量物質與谷胱甘肽協同作用促進環磷酸腺苷發酵生產

李志剛，張朝輝，譚 海，盧南巡，張中華，常景玲,

（1.現代生物育種河南省協同創新中心，河南新鄉 453003；2.河南科技學院生命科技學院，河南新鄉 453003）

環磷酸腺苷（cAMP）是生命體中的第二信使，對細胞的糖、蛋白質以及核苷酸等物質代謝具有重要的調節作用[1?2]。作為藥物具有提高心肌細胞收縮力以及提高機體抗病毒、免疫力的作用，主要用于心血管疾病的治療；作為飼料添加劑廣泛用于畜禽產品的生產中，具有重要的應用價值[3]。

在微生物細胞中，cAMP以ATP為底物直接環化形成，強化能量代謝和ATP合成有利于產物的快速持續積累。以檸檬酸鹽為代表的輔助能量物質，一方面能夠直接作為碳源為細胞提供能量，一方面調節糖酵解與三羧酸循環間的碳流分配，有利于核苷酸的形成，廣泛用于各類高耗能產物的發酵生產中[4?7]。Wang等[8]利用Candida utilis. CCTCC 209298發酵生產腺苷蛋氨酸時添加檸檬酸鈉，細胞能量代謝得到強化，與對照相比，產物濃度提高了27.5%。Chen等[9]利用檸檬酸鈉抑制糖酵解途徑，使更多碳流分配到磷酸戊糖途徑顯著提高了cAMP產量和生產效率。Xia等[10]通過Strptomyces albulusPD-1發酵合成聚賴氨酸時添加檸檬酸，顯著提高了產物濃度。但是，在上述報道中，檸檬酸鹽添加導致發酵后期產物合成停滯或發酵周期不同程度縮短的現象。本實驗室前期開發了利用檸檬酸鈉促進cAMP合成的發酵工藝，發酵后期也存在產物合成停滯的現象[11]。

活性氧（ROS）是由于電子呼吸鏈運行時出現電子泄漏而產生的，幾乎所有好氧型微生物細胞內都會產生[12]。由于細胞具有一定的抗氧化能力，少量ROS產生不會影響細胞正常代謝活動。但是，細胞內能量代謝水平提高，電子呼吸鏈泄漏電子的量也會增加，導致更多ROS產生。如果細胞長時間處于高濃度ROS條件下，細胞膜、酶蛋白以及遺傳物質就會造成損傷，影響細胞活性、生長以及產物的合成[13?14]。

添加輔助能量物質導致cAMP發酵后期產物合成停滯，限制了產物的合成以及產量的進一步提高。針對這一問題，本文對分別添加檸檬酸鈉和丙酮酸鈉的cAMP發酵過程的發酵動力學、菌體活性、能量代謝以及活性氧等的變化規律進行研究，闡明導致產物合成停滯的原因，并提出了耦合添加輔助能量物質和谷胱甘肽的發酵工藝，為進一步促進產物積累以及提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

節桿菌Arthrobactersp. CCTCC2013431 本實驗室篩選并保藏的；NADH、NAD+、AMP、ATP、cAMP、TAB（硫代巴比妥酸）、氯化碘硝基四氮唑（分析純）、NADH/NAD+與NADPH/NADP+測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；乙腈、甲醇、三乙胺、磷酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；AlamarBlue細菌活性檢測試劑盒、DHE-ROS活性氧檢測試劑盒 上海貝博生物科技公司；其他試劑均為分析純。

BIOTECH-7BG發酵罐 上海保興生物設備有限公司；752N紫外分光光度計 上海儀電科學儀器股份有限公司；F-280型熒光分光光度計 天津港東科技股份有限公司；VC150超聲波破碎儀 美國Sonics & Materials公司；Aglient 1260 Infinity液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；Multiskan GO全波長讀數儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 發酵培養基（g/L）：葡萄糖50，K2HPO410，KH2PO410，尿素10，生物素0.005，CoCl20.01，蛋白胨5，次黃嘌呤2，調pH至7.2，121 ℃高溫滅菌20 min。

1.2.2 培養方法 發酵罐培養方法參考文獻[11]。發酵罐裝載5 L發酵培養基，接種量10%，培養溫度30 ℃，初始pH7.4，當pH降至6.8時維持不變。在發酵0、12、19、26、36、43、50、60、67和72 h進行取樣，用于發酵動力學參數、關鍵酶活性、輔因子以及活性氧水平等的測定。檸檬酸鈉、丙酮酸鈉和谷胱甘肽添加方式：發酵0 h添加到發酵液中，添加量分別為3、3和2 g/L，即添加后發酵液中濃度分別達到3、3和2 g/L。對照批次為不添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉和谷胱甘肽的發酵批次。

1.2.3 指標測定

1.2.3.1 菌體濃度測定 采用光密度法測定，發酵液稀釋適當倍數測定600 nm波長下吸光度，測定值乘以稀釋倍數即為菌體濃度OD600；菌體干重（DCW）通過關系式0.46×OD600計算得出[15]。

1.2.3.2 cAMP濃度測定 使用高效液相色譜進行測定[16]，發酵液9000 r/min離心10 min，上清液經0.45 μm水相膜過濾待用。色譜柱為Lichrospher C18柱（300 mm×4.6 mm），進樣量2 μL，有機相為甲醇，水相為磷酸三乙胺緩沖液，水相與有機相體積比70:30，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，波長254 nm。

1.2.3.3 CO2含量測定 尾氣中CO2含量由尾氣分析儀在線測定。

1.2.3.4 細胞活性測定 使用AlamarBlue細菌活性檢測試劑盒，通過熒光分光光度計測定熒光強度表示細胞活性，激發波長540 nm，發射波長590 nm，具體操作方法見說明書。

1.2.3.5 胞內輔因子含量測定 根據cAMP濃度和合成速率的變化規律，選擇26、36、50和60 h等能夠很好反映細胞生理狀態的樣品，對輔因子含量進行測定，后面ROS、MDA水平以及呼吸鏈脫氫酶活性的測定同樣選擇這4個時間的樣品進行測定。取5 mL發酵液在4 ℃條件下，9000 r/min離心10 min，所得菌體于液氮中處理2 min終止菌體代謝，保存于?70 ℃超低溫冰箱中待用。胞內ATP、AMP使用HPLC進行測定，菌體洗滌兩次，懸浮于5 mL PBS緩沖液中，冰浴條件下超聲波破碎10 min，破碎液在低溫條件下12000 r/min離心15 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾后待測。色譜柱為LaChrom C18-AQ柱（250 mm×4.6 mm），有機相為乙腈，水相為NaH2PO4、Na2HPO4和四丁基溴化銨混合溶液，水相與乙腈體積比為92:8，流量0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長258 nm[16]。胞內NADH與NAD+濃度采用試劑盒測定，具體方法見說明書；胞內NADPH與NADP+濃度采用試劑盒測定，具體方法見說明書。

1.2.3.6 呼吸鏈脫氫酶活性 采用氯化碘硝基四氮唑（INT）顯色反應測定[17]。

1.2.3.7 胞內ROS、MDA含量測定 ROS通過DHEROS活性氧檢測試劑盒使用熒光分光光度計測定的熒光強度表示，具體方法見說明書；丙二醛（MDA）含量采用TBA法進行測定，MDA與硫代巴比妥酸在高溫酸性條件下反應生成紅棕色物質，測定532和600 nm波長下吸光度，計算得出，具體方法參照文獻[14,18]；蛋白濃度采用考馬斯亮藍染色法測定[19]。

1.2.3.8 生長速率和cAMP合成速率的計算

式中：RX和RP分別表示相臨取樣點間隔時間內的平均細胞生長速率和cAMP合成速率，g/（L·h）；t1表示起始發酵時間，h；t2表示節點發酵時間，h；c（X）和c（P）分別表示細胞濃度（OD600）和cAMP濃度，g/L；參數取三次測定值得平均值。

1.3 數據處理

發酵罐培養實驗定時取樣，測定發酵指標時每個樣品測三次。用Excel進行數據處理，應用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 添加輔助能量物質對cAMP發酵性能的影響

在7 L發酵罐上進行了分別添加檸檬酸鈉和丙酮酸鈉的發酵實驗，分析輔助能量物質對cAMP發酵性能和細胞代謝的影響，探尋進一步促進產物合成的方法。如圖1A所示，三個發酵批次的菌體終濃度相差不大，但是，與對照相比，添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉批次的菌體濃度在50 h前明顯處于較高水平，50 h后這兩批次的菌體生長停滯，而對照批次仍保持緩慢增長的狀態。圖1B結果顯示，三批次的菌體生長速率在24 h均達到最大值，此時添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉發酵批次比對照的分別提高了43.5%和60.2%，之后迅速下降，32 h至發酵結束一直低于對照批次，55 h后這兩批次的生長速率變為負值。cAMP測定結果表明，添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉批次的cAMP濃度在50 h達到最大值3.68和4.02 g/L，分別比對照提高10.8%和21.1%，50 h后cAMP濃度不再增加，而對照仍保持不斷增加的狀態（圖1C）。另外，三批次的cAMP合成速率在32 h均達到最大值，與對照相比，添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉批次的合成速率分別提高了48.2%和61.6%，之后迅速下降，40 h后一直低于對照，55 h后合成速率變為負值（圖1D）。這表明，輔助能量物質能夠有效促進菌體生長和cAMP合成，使菌體和產物濃度迅速積累，但在發酵后期細胞生長變的緩慢，產物合成開始停滯，前期的良好狀態不能繼續維持。相關報道表明，檸檬酸鹽和丙酮酸鹽[20?21]作為輔助能量物質可以強化能量代謝，具有促進菌體快速生長，促進肌苷、聚賴氨酸及腺苷蛋氨酸等多種發酵產物積累的作用，但也存在發酵周期縮短以及后期產物合成停滯的現象[7?10]。因此，闡明輔助能量物質導致發酵后期細胞生長緩慢、產物合成停滯的原因，對進一步促進這些產物合成與積累具有重要意義。

圖1 添加輔助能量物質對細胞生長和cAMP發酵合成的影響Fig.1 Effects of auxiliary energy substances on cells growth and cAMP fermentation synthesis

尾氣中CO2含量反映了細胞呼吸代謝的強度，而利用AlamarBlue檢測試劑盒測得的熒光強度則反映了菌體細胞的活性。對上述發酵批次中菌體的呼吸強度和細胞活性進行測定，結果如圖2所示。三個批次的CO2含量和細胞活性均呈現先升后降的變化規律，對照批次的變化趨勢相對平緩，而添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉發酵批次的CO2含量和細胞活性在發酵前期快速提升，明顯高于對照批次，在發酵36 h后迅速下降，在50 h后明顯低于對照批次。這表明輔助能量物質在前期可以明顯提高細胞活性，但此狀態未能長時間維持，可能是細胞受到損傷，導致細胞活性下降，進而使菌體生長和產物合成能力弱化。

圖2 輔助能量物質對細胞活性及呼吸代謝的影響Fig.2 Effects of auxiliary energy substances on cell viability during fermentation period

2.2 添加輔助能量物質對細胞能量代謝的影響

對反映細胞能量代謝水平的胞內輔因子含量和電子呼吸鏈活性進行了測定，結果如圖3所示。與對照相比，添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉發酵批次的NADH/NAD+得到極顯著（P<0.01）提高（60 h前），ATP/AMP在發酵前期明顯高于對照，但50 h后劇烈下降，明顯低于對照；同時呼吸鏈脫氫酶活性也表現出與ATP/AMP相同的變化趨勢。檸檬酸鹽和丙酮酸鹽作為輔助能量物質，能夠提高三羧酸循環的代謝水平，提高胞內NADH/NAD+比例，進而促進ATP的合成[20,22]。電子呼吸鏈能夠接受NADH的電子，將其氧化形成NAD+，電子經呼吸鏈傳遞釋放能量，催化磷酸化反應合成ATP，電子呼吸鏈是細胞ATP合成的重要途徑[23?24]。因此，可以推測，發酵前期輔助能量物質有效提高了NADH/NAD+，在電子呼吸鏈高效運行的情況下大量合成ATP，為菌體生長和產物合成提供了有利條件；但由于呼吸鏈高速運行增加了電子的泄漏，產生大量的活性氧自由基，造成細胞組分損傷和呼吸鏈相關酶活性的降低，導致發酵后期ATP/AMP極顯著低于對照（P<0.01），進而影響菌體活性和產物合成。

圖3 添加輔助能量物質對細胞能量代謝的影響Fig.3 Effects of auxiliary energy substances on cell energy metabolism

2.3 添加輔助能量物質對細胞內活性氧和丙二醛水平的影響

對菌體細胞內的活性氧（ROS）含量及脂質過氧化標志物丙二醛（MDA）的濃度進行測定，結果如圖4所示。在對照批次中，胞內ROS和MDA濃度隨發酵的進行逐漸增加，但提高幅度很小，未對細胞產生大的損傷，菌體生長和產物合成在72 h的發酵周期內一直進行（圖1）。然而，在添加輔助能量物質的批次中，胞內ROS和MDA濃度隨發酵的進行快速增加，在26~36 h增加幅度尤為明顯，而且在26 h后ROS和MDA濃度與對照相比，有極顯著（P<0.01）的提高。此外，還對胞內NADPH/NADP+進行了測定，如圖4C所示，添加輔助能量物質批次的NADPH/NADP+在發酵過程中變化幅度很大，26 h明顯高于對照批次，36 h及以后與對照批次相比，有極顯著（P<0.01）的下降，最終比例僅為0.6左右的低水平。NADPH主要為細胞物質合成提供還原力以及維持氧化還原平衡，NADPH/NADP+大幅下降可能是細胞內出現氧化脅迫導致的[25?26]。以上現象表明，發酵后期，強氧化性的活性氧自由基大量積累[27]，導致氧化還原失衡，超出細胞的承受能力，細胞膜等遭到損害，細胞活性降低，最終導致發酵后期產物合成停滯的現象。

圖4 輔助能量物質激發氧化脅迫造成細胞物質損傷Fig.4 Addition of auxiliary energy substances triggered oxidative stress causing cell damage

2.4 谷胱甘肽與輔助能量物質耦合添加促進cAMP發酵合成

谷胱甘肽（GSH）是一種發酵工業中常用的抗氧化劑，具有清除氧自由基的作用[28?29]。針對添加輔助能量物質導致氧化脅迫的問題，進行了谷胱甘肽與輔助能量物質耦合添加的發酵實驗，結果如圖5所示。耦合添加批次的菌體濃度和cAMP產量明顯高于單獨添加GSH批次，由于GSH的作用，發酵后期菌體和產物濃度持續增加，沒有停滯和下降的趨勢。檸檬酸鈉耦合GSH與丙酮酸鈉耦合GSH批次的cAMP產量分別達到4.05和4.32 g/L，比單獨添加GSH批次分別提高了15.2%和22.7%，與圖1中對照相比分別提高了21.9%和30.1%。此外，與僅添加GSH批次相比，耦合添加批次的CO2含量和細胞活性明顯處于較高水平；與相應未添加GSH的批次相比，耦合添加批次的細胞活性也明顯得到提高（圖2）。這表明添加GSH有效解決了由輔助能量物質導致的氧化脅迫問題，菌體活性得到明顯提升，產物在發酵后期能夠持續合成。

圖5 谷胱甘肽提高細胞活性促進cAMP發酵合成Fig.5 Exogenous glutathione enhanced cells viability and cAMP production

3 結論

單獨添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉批次的產物合成和菌體生長速率在發酵前期均明顯高于對照，約30 h后快速下降，降至低于對照批次的低水平；菌體活性、ATP/AMP以及電子呼吸鏈活性在發酵36 h后劇烈下降，下降幅度遠遠大于對照批次。添加輔助能量物質導致ROS和丙二醛在發酵36 h后迅速積累，而NADPH/NADP+卻快速下降，表明輔助能量物質導致活性氧大量產生，造成細胞組分損傷以及細胞生長和產物合成的停滯。耦合添加輔助能量物質和谷胱甘肽的發酵批次中，發酵后期細胞和產物濃度持續增加，細胞活性也得到較大提升，cAMP產量得到進一步提高。