高產高純度果膠甲酯酶黑曲霉工程菌的構建

韓萌萌，蓋金明，姜慶豐，張 會，李 杰

（東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030）

果膠甲酯酶對果膠分子中的甲酯基團具有高度專一性，可以將其催化水解形成果膠酸，并釋放氫離子和甲醇。由于具有這一特性，果膠甲酯酶在工業當中得到廣泛的應用[1?2]。果膠甲酯酶可以將高酯果膠變成低酯果膠，低酯果膠是具有較高價值的工業原料[3]，低酯果膠還可作為藥物的組成成分，加快傷口愈合，減少血漿中的膽固醇。目前生產低酯果膠的最佳方法是果膠甲酯酶法生產，而低酯果膠產品的品質高度依賴于果膠甲酯酶制劑的純度[4?6]。果膠甲酯酶還應用于造紙工業的白水處理[7?8]，在飼料工業中它與其他酶系復合使用還可以提高飼料轉化利用率[9]。此外由于果膠甲酯酶在罐頭、果汁、泡菜等食品行業有較多的應用[10?12]，因此，食品級果膠甲酯酶的需求量也在逐年增加，食品級果膠甲酯酶商品純度的要求也很高[13?14]。

目前市面上銷售的果膠甲酯酶多為黑曲霉發酵生產[15]，而黑曲霉在發酵生產果膠甲酯酶的過程當中還同時分泌許多其他酶類，這就導致了在下游分離純化果膠甲酯酶的過程當中產生產量的損失以及酶活的損耗[16?17]。同時分離純化的工藝步驟也大大增加了產酶的成本，使得果膠甲酯酶的價格較高，并且目前果膠甲酯酶的分離純化工藝也并不完善，最終的產品純度也得不到保證[18]，這對于一些高度依賴于果膠甲酯酶純度的產品的生產是不利的。所以，獲得高產高純度果膠甲酯酶的工程菌具有重大的商業價值[19?20]。

本實驗從果膠酶生產菌株黑曲霉種克隆了果膠甲酯酶基因pmeA，構建了由PglaA6R啟動子和SglaA信號肽調控的表達載體pSZHG6R-pmeA，通過農桿菌介導法轉化糖化酶生產菌黑曲霉TH-2，獲得高效分泌表達果膠甲酯酶的純合重組菌株TH-2（glaA::pmeA）。進一步通過敲除重組菌株TH-2（glaA::pmeA）中的asaA基因和優化發酵培養基，去除了背景蛋白，從而獲得了高產高純度果膠甲酯酶的工程菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉TH-2、黑曲霉果膠酶生產菌、農桿菌AGL1、AGL1（pSZH-ΔpyrG）、AGL1（pSZHA-pyrG），大腸桿菌DH5α、載體pSZHG6R 由真菌遺傳研究室保存；限制性核酸內切酶、T4DNA Ligase Takara公司；基因組DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒 康為世紀公司；利福平、卡那霉素、氨芐霉素、乙酰丁香酮、PCR引物（表1） 生工生物公司。

表 1 PCR引物序列Table 1 PCR Primer sequence

PCR儀 杭州晶格科學儀器有限公司；T960型熱循環儀、SDS-PAGE電泳系統 美國伯樂生命醫學產品有限公司；Mini-PROTEAN? Tetra蛋白質電泳系統、凝膠成像系統 上海天能科技有限公司；Tanon 2500R全自動數碼凝膠圖像分析系統、控溫水槽 上海博迅實業有限公司；DK-8D三溫三控水槽、紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司； UV-5800PC型紫外可見分光光度計、恒溫振蕩培養箱美國精騏科技與產業有限公司；IS-RDD3型臺式恒溫振蕩器、高壓蒸汽滅菌鍋 美國致微儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 果膠甲酯酶基因的擴增 依據黑曲霉pmeA基因組序列（Gene ID: 4980618），應用軟件DNAMAN8.0設計用于擴增去除分泌信號肽編碼序列的pmeA基因引物P1、P2。提取黑曲霉果膠酶生產菌的基因組，用引物P1、P2進行PCR擴增，基因組提取實驗步驟和PCR擴增實驗步驟參照文獻[21]，回收約1300 bp的目的條帶，克隆測序，將測序正確的質粒命名為pMD-pmeA。

1.2.2 表達載體的構建 用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切質粒pMD-PmeA，回收約1300 bp的pmeA基因片段。用NheⅠ和HindⅢ雙酶切實驗室保存的pSZHG6R載體，回收載體片段。用T4DNA Ligase將這兩個片段23 ℃連接2 h，隨后將其轉化到大腸桿菌DH5α中，過夜培養，挑取單菌落提質粒，XbaⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定表達載體pSZHG6R-pmeA是否構建成功。

1.2.3 凍融法轉化農桿菌 用凍融法將表達載體pSZHG6R-pmeA轉入農桿菌AGL1中[22?23]，用引物P3、P2進行菌落PCR鑒定。

1.2.4 黑曲霉轉化和純合轉化子鑒定 取勻漿后的新鮮黑曲霉TH-2菌絲與活化后的農桿菌AGL1（pSZHG6R-pmeA）菌液各150 μL混合，涂布在貼玻璃紙的固體PDA平板培養基上，30 ℃恒溫培養。待長出菌落，將玻璃紙及其上菌落翻轉倒扣在添加300 μg/mL潮霉素的 PDA平板上進行篩選。30 ℃培養1 d后，將玻璃紙揭下，繼續30 ℃恒溫培養。待上述培養皿長出菌落，挑取至添加300 μg/mL潮霉素的 PDA液體培養基中，30 ℃靜止培養3~6 d，取菌絲提取基因組DNA。以TH-2基因組DNA為模版，用引物P3、P4進行PCR擴增，將PCR產物用HindⅢ酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳[22?23]。獲得的純合重組菌株命名為TH-2（glaA::pmeA）。

1.2.5asaA基因的敲除 首先根據同源重組的原理敲除TH-2（glaA::pmeA）中的pyrG基因。將黑曲霉TH-2（glaA::pmeA）與農桿菌AGL1（pSZH-ΔpyrG）共培養。篩選培養基為含5-FOA和尿苷的CD培養基，用引物P5、P6進行鑒定，其他方法和步驟同1.2.4。獲得的純合重組菌株命名為TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）。

然后根據同源重組的原理敲除TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）中的asaA基因。將黑曲霉TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）與農桿菌AGL1（pSZHA-pyrG）進行共培養。篩選培養基為CD培養基，用引物P7、P8進行鑒定，其他方法和步驟同1.2.4。獲得的純合重組菌株命名為TH-2（glaA::pmeAΔpyrGasaA::pyrG）。

1.2.6 SDS-PAGE 取新鮮的黑曲霉菌株，接種于100 mL液體發酵培養基（玉米漿20 g/L，豆餅粉30 g/L，葡萄糖100 g/L）中，30 ℃，200 r/min培養。將3~9 d的發酵上清液10 μL與10 μL的2×Protein loading buffer混合，沸水浴5~8 min使其中蛋白質變性。以Protein marker作為對比，將3~9 d發酵上清液進行SDS-PAGE檢測，濃縮膠電壓為100 V，分離膠電壓為120 V。電泳結束后用考馬斯亮藍過夜染色，后用脫色液脫色4~6 h。

1.2.7 果膠甲酯酶酶活的檢測 取3~9 d重組菌株TH-2（glaA::pmeA）或TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）的發酵上清液測定果膠甲酯酶酶活。酶活定義為：在50 ℃，pH8.5的條件下，1 mL酶液每分鐘催化果膠水解生成甲醛的μmol數為一個酶活力單位，即1 U。具體檢測方法參照文獻[18]。

1.2.8 果膠甲酯酶酶學性質的檢測 將重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）進行發酵培養，取第6 d的發酵上清液，在pH區間3~8.5范圍內，以0.5為梯度逐一進行果膠甲酯酶酶活檢測，對比不同pH條件下，果膠甲酯酶酶活的變化情況。在溫度區間為20~80 ℃范圍內，以10 ℃為梯度逐一進行果膠甲酯酶酶活檢測，對比不同溫度條件下，果膠甲酯酶酶活的變化情況。

2 結果與分析

2.1 果膠甲酯酶pmeA基因的克隆

提取果膠酶生產菌的基因組，用基因特異性引物P1、P2克隆出1267 bp的果膠甲酯酶基因pmeA如圖1所示。將此條帶與pMD-19T連接并轉入大腸桿菌DH5α中，提取大腸桿菌質粒。將測序得到的質粒序列進行Blast比對，結果表明此序列與Gene ID: 4980618的序列相似性為100%。

2.2 表達載體pSZHG6R-pmeA的構建

用基因特異性引物P1、P2克隆出1347 bp的果膠甲酯酶基因pmeA。回收目的基因并與pMD-19T載體相連，轉入大腸桿菌受體中，進行大腸桿菌質粒的提取，得到質粒pMD-pmeA，并用限制性內切酶XbaⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，可切出大小為1347 bp和2700 bp的片段，將雙酶切回收的pmeA基因片段與pSZHG6R載體連接。提取轉化子的質粒，用XbaⅠ和HindⅢ對其進行雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果如圖2所示，1號泳道顯示出2條條帶，分別約15000 bp和4000 bp，證明表達載體pSZHG6RpmeA構建成功。

圖 1 pmeA基因擴增結果Fig.1 Cloning of pmeA by PCR

圖 2 pSZHG6R-pmeA雙酶切鑒定結果Fig.2 Identification results of pSZHG6R-pmeA double digestion

2.3 凍融法轉化農桿菌

表達載體pSZHG6R-pmeA凍融法轉化農桿菌的菌落PCR鑒定結果如圖3所示，1號泳道與質粒pSZHG6R-pmeA的陽性對照泳道擴增條帶大小相同，證明表達載體pSZHG6R-pmeA成功轉入農桿菌中。

圖 3 表達載體pSZHG6R-pmeA轉化農桿菌的菌落PCR結果Fig.3 Colony PCR results of expression vector pSZHG6RpmeA transformed into Agrobacterium tumefaciens

2.4 過表達pmeA純合轉化子的篩選和鑒定

以篩選到的黑曲霉菌株基因組DNA為模版，用引物P3、P4進行PCR擴增，將PCR產物用HindⅢ酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖4所示，1~3號重組菌株可獲得與陽性對照質粒pSZHG6RpmeA相同的條帶。所以1~3號重組菌株均為純合轉化子，命名為TH-2（glaA::pmeA）。

圖 4 黑曲霉重組轉化子的PCR酶切鑒定結果Fig.4 Identification results of PCR digestion of recombinant transformants of Aspergillus niger

2.5 重組菌株TH-2（glaA::pmeA）的發酵與檢測

黑曲霉重組菌株TH-2（glaA::pmeA）發酵液上清SDS-PAGE結果如圖5所示，在液體發酵培養基中添加1%的硫酸銨后，SDS-PAGE結果如圖6所示。由圖5可知，52 kDa的α-淀粉酶條帶和60 kDa的酸穩定的α-淀粉酶條帶為重組菌株的背景蛋白，但在45 kDa處增加了一條明顯的蛋白條帶，與預測的PmeA分子量34 kDa不符。NetNGlyc 1.0 Server分析結果表明，在PmeA中有4個潛在的N糖基化位點，推斷是N糖基化修飾增大了PmeA的分子量。發酵上清液酶活檢測結果如圖7所示，重組菌株發酵第9 d酶活達到467.77 U/mL。

圖 5 基本發酵培養基重組菌株TH-2（glaA::pmeA）SDS-PAGE檢測結果Fig.5 SDS-PAGE detection results of recombinant strain TH-2（glaA::pmeA）in basic fermentation medium

由圖5可知，加入硫酸銨的TH-2（glaA::pmeA）發酵樣本α-淀粉酶條帶逐漸消失。由圖7可知，加入硫酸銨后酶活與對照樣本相比略有提升，其發酵第8 d酶活最高，達到491.44 U/mL。

圖 6 添加硫酸銨發酵培養基重組菌株TH-2（glaA::pmeA）SDS-PAGE檢測結果Fig.6 SDS-PAGE detection results of recombinant strain TH-2（glaA::pmeA）in fermentation medium with ammonium sulfate

圖 7 重組菌株TH-2（glaA::pmeA）的酶活檢測結果Fig.7 Enzyme activity test results of recombinant strain TH-2（glaA::pmeA）

2.6 重組菌株TH-2（glaA::pmeA）中pyrG基因的敲除

將含敲除原位pyrG基因載體的農桿菌AGL1（pSZH-ΔpyrG）與黑曲霉工程菌TH-2（glaA::pmeA）進行共培養，提取轉化子的基因組DNA進行PCR擴增和HindIII酶切鑒定，結果如圖8所示。1~10號樣本出現400 bp左右條帶，與陰性對照條帶相同，為未轉化的出發菌株TH-2（glaA::pmeA）。11、12、13號樣本與陽性對照質粒pSZH-ΔpyrG的電泳條帶相同，均未出現TH-2菌株中的400 bp條帶，證明為敲除pyrG基因的純合轉化子，命名為TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）。

圖 8 敲除pyrG基因的重組轉化子PCR鑒定結果Fig.8 PCR identification results of recombinant transformants knocked out of pyrG gene

2.7 重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）中asaA基因的敲除

使用本實驗室已構建好的敲除asaA基因的農桿菌AGL1（pSZHA-pyrG）與黑曲霉工程菌TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）進行共培養。提取轉化子的基因組DNA進行PCR擴增和HindIII酶切鑒定。結果如圖9所示，1~8號重組菌株與陽性對照質粒pSZHApyrG的電泳條帶相同，證明為敲除asaA基因的純合轉化子，命名為TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）。

圖 9 敲除asaA基因的重組轉化子PCR酶切鑒定結果（HindIII）Fig.9 Identification results of PCR digestion of recombinant transformants knocked out asaA gene（HindIII）

2.8 重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）的發酵與檢測

將上述重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）在添加1%硫酸銨的發酵培養基中發酵培養，并進行SDS-PAGE檢測，結果如圖10所示。在發酵第6 d后可以得到一條明顯的果膠甲酯酶蛋白條帶，重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasAA）不再分泌60 kDa的酸穩定α-淀粉酶，同時通過加入硫酸銨降解了其分泌的52 kDa的α-淀粉酶背景蛋白。

圖 10 重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）SDS-PAGE檢測結果Fig.10 Recombinant strain TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）SDS-PAGE test results

取1號純合重組菌株3~8 d上清發酵液進行酶活測定，結果如圖11所示，第8 d酶活最高，可達255.40 U/mL，可以表明1號純合重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果膠甲酯酶具有較高酶活。

圖 11 重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）的酶活檢測結果Fig.11 Enzyme activity test results of recombinant strain TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）

2.9 重組果膠甲酯酶的酶學性質測定

取純合重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）發酵第8 d上清液。對其在不同溫度條件下的酶活進行測定，以50 ℃時的酶活為計算標準，結果如圖12所示，在50 ℃時果膠甲酯酶活性到達峰值，隨后逐漸回落。其中作用溫度為50 ℃時的酶活為263.85 U/mL，作用溫度為80 ℃時的酶活仍能達到191.24 U/mL，比在常溫20 ℃條件下的酶活性還要高。可以得出結論，純合重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果膠甲酯酶的最適作用溫度為50 ℃，并具有較好的耐熱性，在80 ℃高溫條件下仍能維持其酶活性的70%以上。

圖 12 重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）不同溫度的酶活檢測結果Fig.12 Recombinant strain TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）enzyme activity test results at different temperatures

取純合重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的第6 d發酵上清液。對其在不同pH條件下的酶活進行測定，以pH為8.5時酶活為計算標準，結果如圖13所示，其中作用pH為4時的酶活最高，最高酶活為397.50 U/mL，為pH為8.5時酶活的195%。隨后酶活隨pH增加呈逐漸下降趨勢。可以得出結論，純合重組菌株TH-2（glaA::PmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果膠甲酯酶的最佳pH作用范圍是3.0~5.0之間，最適作用pH為4.0。

圖 13 重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）不同pH的酶活檢測結果Fig.13 Recombinant strain TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）enzyme activity test results at different pH

3 討論與結論

本實驗成功構建果膠甲酯酶的超量表達載體，并將其轉入受體菌TH-2中，獲得純合重組菌株TH-2（glaA::pmeA）。在發酵培養基中加入硫酸銨，可以有效消除背景蛋白中的α-淀粉酶。可能因為硫酸銨被菌體利用后，使得發酵培養基pH下降[24?26]，而菌體在發酵后期也會分泌酸性物質，最終導致發酵后期培養基pH下降幅度更大，激活了胞外的酸性蛋白酶活性，使α-淀粉酶被分解[27?28]，趙波等[29]為控制酵母高密度發酵過程中pH的變化，在發酵液中添加硫酸銨取得成效。但是在此條件下，背景蛋白中的酸穩定α-淀粉酶未被分解。進一步敲除了酸穩定α-淀粉酶基因獲得純合重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA），通過發酵時加入硫酸銨，獲得純度較高的果膠甲酯酶[30?31]。但測得其最高發酵酶活為255.40 U/mL，低于同樣條件下的黑曲霉工程菌TH-2（glaA::pmeA）的酶活491.44 U/mL，可能是asAA基因或pyrG基因的敲除對菌體的生長和代謝產生了不利影響，其原因還有待于進一步研究。

重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果膠甲酯酶在50 ℃條件下酶活性最高，最高酶活達263.85 U/mL；并且在80 ℃的高溫條件下，仍能保持酶活性的70%以上。其最適作用的pH范圍是3.0~5.0，最佳作用pH為4.0，在pH4.0時，最高酶活達397.50 U/mL。所以，純合重組菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果膠甲酯酶在酸性條件下酶促效率更高；此外，在pH為7.0時，其酶活性為最適作用pH時的60%左右。表明用本研究構建的工程菌生產的果膠甲酯酶具有較寬的作用溫度和pH范圍，具有很好的應用前景。