鹽脅迫對不同時期鹽地堿蓬組分含量的影響

孟 然，楊雅華，李趙嘉，王秀萍，薛志忠

（河北省農林科學院濱海農業研究所，唐山市植物耐鹽研究重點實驗室，河北唐山 063200）

隨著生態環境的惡化，鹽漬化土壤成為農業發展面臨的重要問題之一，嚴重制約著農作物的生長發育，對農業生產造成很大的威脅，導致土壤退化，土地利用率降低。鹽生植物是一類能夠在鹽堿化程度較高的土壤中生長的植物，不僅對鹽堿地區的土壤、氣候等環境條件具備很強的適應性，而且可對土壤起到積極的修復作用，增加土壤養分含量、降低土壤中重金屬含量等[1?2]。

鹽地堿蓬〔Suaeda salsa（L.）Pall.〕又名翅堿蓬，俗名黃須菜，為藜科堿蓬屬一年生草本鹽生植物[2]，一般生于鹽堿荒地上，耐鹽性極強，是鹽堿地的典型指示植物[3]。鹽地堿蓬幼芽鮮嫩可以食用，含有蛋白質、維生素、膳食纖維、脂肪酸、礦物質、黃酮類化合物等化學成分[4]，其中維生素尤以抗壞血酸含量最為突出，最高可達到822 μg/g，與蔬菜中含量較高的辣椒幾乎相當，可作為野生蔬菜中較好的抗壞血酸來源[5]；蛋白質與膳食纖維共同占干物質總量的30%以上[4]；氨基酸含量豐富，種類齊全，必需氨基酸構成合理[6]，是一種極具營養價值的野菜，被譽為“菜中靈芝”[7]，也是鹽堿地區家家戶戶常食野菜之一。

亞硝酸鹽超標已經成為影響食品安全的重要原因之一，由于生長環境的特殊性，鹽地堿蓬等野菜中亞硝酸鹽含量顯然成為一項重要監測指標。現有文獻多記載山東鹽城、東營及山西汾河灘地區堿蓬亞硝酸鹽情況，不同地區堿蓬亞硝酸鹽含量存在較大差異，部分亞硝酸鹽含量超過了聯合國糧食農業組織/世界衛生組織規定和中國食品安全國家標準（亞硝酸鹽含量≤20 mg/kg）[8]。當前，隨著對鹽地堿蓬作為優質的蔬菜、經濟作物和具有醫療保健價值屬性的充分認識，鹽地堿蓬資源的開發引起人們的重視，但缺少對品質控制較為系統的研究。

本試驗以鹽地堿蓬為研究對象，考察了不同濃度鹽脅迫處理對不同生長時期的鹽地堿蓬水分、蛋白質、氨基酸、抗壞血酸、亞硝酸鹽和總黃酮含量的影響，了解鹽地堿蓬的耐鹽性；利用優化后的鹽地堿蓬總黃酮提取方法對鹽地堿蓬總黃酮含量進行測定，以期為鹽地堿蓬栽培提供技術支撐，為其總黃酮的提取及產品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

曹妃甸沿海地區野生的鹽地堿蓬〔Suaeda salsa（L.）Pall.〕 2019年3月17日播種，于苗期、花期、結果期（每段時期的第10 d分別取樣）選取生長良好的植株采集地上部分10 cm作為待測樣本；蘆丁標準品（批號：R701800） 德國Dr.Chemical有限公司；纖維素酶（貨號：C805042，10000 U/g）、果膠酶（貨號：P816736，30000 U/g） 上海麥克林生化科技有限公司；磷酸、甲醇色譜醇 Fisher Chemical公司；無水乙醇、草酸、抗壞血酸、碳酸氫鈉、2,6-二氯酚靛酚 分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司；氨基酸含量檢測試劑盒（貨號：BC1570）、亞硝酸鹽含量測定試劑盒（貨號：BC1490）、雙縮脲法蛋白質含量檢測試劑盒（貨號：BC3180） 北京Solaibio科技有限公司；水為屈臣氏純凈水。

AP124W電子天平 島津公司；JT-1027HTD機械超聲波清洗機 深圳市潔拓超聲波清洗設備有限公司；D-37520 osterode臺式高速冷凍離心機 Biofagestratos公司；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 上海力辰邦儀器科技有限公司；SCIENTZ-48組織研磨機 寧波新芝生物科技股份有限公司；1200型高效液相色譜儀 Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹽脅迫處理方法 試驗在河北省農林科學院濱海農業研究所濱海農業綜合試驗基地地下式水泥池內進行。為保證鹽脅迫后各項指標檢測結果的準確性，采用寧亞茹和李趙嘉等[9?10]的自吸水裝置進行鹽脅迫處理，土壤鹽度梯度分別設定為0.30%、0.60%、0.90%、1.20%共4個處理，以低鹽漬土（含鹽量為0.10%）為對照CK。每個處理設6盆重復，每盆8株。經鹽脅迫處理后于苗期、花期、結果期分別取樣測定各組分含量。

1.2.2 組分測定 將每一份鹽地堿蓬樣本分成兩部分，一部分留用鮮樣待測，一部分用流動水洗去表面泥沙，再用蒸餾水沖洗3~4次，自然陰干，烘干后粉碎過100目篩，粉末備用。

1.2.2.1 基本營養成分含量的測定 水分、抗壞血酸、蛋白質、氨基酸含量采用鮮樣測定。水分含量測定：參照GB 5009.3-2016食品安全國家標準食品中水分的測定——直接干燥法[11]；抗壞血酸含量測定：參照GB 5009.86-2016《食品安全國家標準-抗壞血酸的測定》——2,6-二氯酚靛酚滴定法[12]。

蛋白質含量測定：雙縮脲法蛋白質含量檢測試劑盒法。蛋白質（mg/g 質量）=C標準管/（A標準管?A空白管）×（A測定管?A空白管）×V樣總/W。式中，C標準管：5 mg/mL；A標準管：標準管的吸光值；A空白管：空白管的吸光值；V樣總：樣本總體積，1 mL；W：樣本質量，g。

氨基酸含量測定：氨基酸（AA）含量檢測試劑盒法。氨基酸含量（μmol/g 質量）=[C標準管×V標準管×△A測定管/△A標準管]×（V樣總/V樣）/W。式中，C標準管：標準品濃度，10 μmol/mL；V標準管：反應體系中加入標準品體積，0.05 mL；V樣總：樣本總體積，1 mL；V樣：反應體系中加入樣本體積，0.05 mL；W：樣本質量，g。

1.2.2.2 亞硝酸鹽含量的測定 亞硝酸鹽含量測定：食品中亞硝酸鹽含量檢測試劑盒法，采用鮮樣測定。亞硝酸鹽含量（μmol/g 質量）=0.12×[（A樣品?A空白）/（A標準?A空白）]/W。式中，A樣品：測定管的吸光值；A空白：空白管的吸光值；A標準：標準管的吸光值；W：樣本質量，g。

1.2.2.3 總黃酮含量的測定 采用超聲波輔助甲醇提取法提取鹽地堿蓬總黃酮[13]，稱取0.25 g鹽地堿蓬莖葉干燥樣品（料液比1:100 g/mL）置于容量瓶中，加入5 mL混合酶（0.1%纖維素酶+0.1%果膠酶）溶液；于60 ℃水浴30 min，容量瓶中根據甲醇濃度計算用量，加入無水甲醇將醇濃度調至70%，最后用70%甲醇溶液定容；超聲120 min，超聲功率360 W，水溫60 ℃；利用一次性注射器和一次性0.45 μm針頭式過濾器將最終提取液注入至進樣瓶中備用，待進樣檢測。

選取超聲功率（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）、料液比（D）為主要評定因素進行考察，各因素的水平設定如表1。

表1 L16（44）正交試驗因素水平表Table 1 L16(44) level table of orthogonal test factor

參考郭麗霞[14]的方法并有所修改，以蘆丁標準品制作標準曲線，以峰面積定量，對不同鹽濃度脅迫處理、不同生長時期的鹽地堿蓬提取液進行HPLC分析，利用標準曲線法，通過回歸方程對樣品中的總黃酮（以蘆丁計）進行定量分析。HPLC條件：色譜柱：Dikma C18柱（4.6 mm×250 nm，5 μm）；流動相：A（體積分數0.2%的磷酸水溶液）：B（甲醇）=50:50；檢測波長：350 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。流動相均經真空泵過濾除雜和超聲清洗機脫氣。

1.3 數據分析

試驗所得數據采用SPSS Statistics 23.0統計軟件進行描述性分析，分析各指標的均值、極值、標準差和變異系數，并進行one-way ANOVA方差分析，運用Duncan檢驗法對品質指標含量分別進行顯著性評價，P<0.05認為結果差異顯著。

變異系數（CV）=（標準差/平均值）×100%。標準差=其中xˉ=樣本的平均值，n=樣本的數量，xi=樣本的個體（i=1,2···n）。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對鹽地堿蓬各組分變異程度的影響

圖1 為不同生長時期不同鹽脅迫的鹽地堿蓬各組分變異系數比較，由圖1可知，水分含量變異系數最低，亞硝酸鹽變異系數處于最高值。說明水分含量差異性最小，亞硝酸鹽差異性最大，鹽脅迫對水分含量影響不明顯，對亞硝酸鹽含量具有明顯影響。苗期、花期和結果期水分含量的變異系數分別為5.58%、4.33%和2.30%，其中苗期水分含量變異系數最大，結果期變異系數最小，說明水分含量變化在苗期比結果期更明顯。亞硝酸鹽含量在三個時期中變異系數大小排名為：苗期、結果期、花期，其中苗期變異系數最大，達95.76%，花期變異系數最小，說明亞硝酸含量在苗期變化比花期更明顯。同樣，苗期抗壞血酸和黃酮含量的變異系數最高，結果期氨基酸和蛋白質含量變異系數顯示最高值。綜上，鹽分對苗期鹽地堿蓬水分、亞硝酸鹽、抗壞血酸和黃酮含量影響較大，對結果期氨基酸和蛋白質含量影響較大。

圖1 不同生長時期鹽脅迫下鹽地堿蓬指標變異系數Fig.1 Coefficient of variation of the indicators of Suaeda salsaunder salt stress in different growth periods

2.2 鹽脅迫對不同時期鹽地堿蓬水分含量的影響

一般情況下，鹽脅迫會影響植物營養品質變化，但因種類、鹽脅迫程度和生長時期不同，影響有所差異。由圖2可知，三個生長時期相比較，苗期鹽地堿蓬水分含量最高，除0.30%組外，與花期、結果期結果差異顯著（P<0.05）；且在0.30%和0.60% NaCl濃度時，花期與結果期水分含量差異顯著（P<0.05）。隨土壤NaCl濃度增加，苗期鹽地堿蓬水分含量呈持續上升的趨勢，當NaCl濃度為1.20%時，水分含量達到最大值93.71%，較對照差異顯著（P<0.05），增加了13.30%。由此可知，在試驗所設定的土壤NaCl濃度下，促進了其莖葉含水量的增加，植株細胞內水分存在狀態相對平衡穩定，生命活動正常。因此，鹽脅迫有利于提升苗期鹽地堿蓬水分含量。在0.30% NaCl濃度時，花期鹽地堿蓬水分含量達最大值80.22%，與對照組及其他濃度相比具有顯著性差異（P<0.05），而其他四組之間并無顯著差異（P>0.05）。這說明施加一定濃度的鹽處理更有利于花期鹽地堿蓬水分含量的增加，提高其保水能力，而鹽脅迫濃度過高（大于0.30%），水分吸收和葉片保水能力都會減弱，從而抑制了水分含量的增加。隨土壤NaCl濃度增加，結果期鹽地堿蓬水分含量呈先下降后上升的趨勢，在0.90% NaCl濃度時水分含量最低，為68.68%，與對照組呈顯著差異（P<0.05），降低了5.43%；1.20%NaCl濃度時水分含量略有上升，但與對照組、最低值差異均不顯著（P>0.05），也就是說鹽脅迫對結果期的鹽地堿蓬水分含量影響不明顯。

圖2 鹽脅迫對鹽地堿蓬水分含量的影響Fig.2 Effect of salt stress on thecontent of water of Suaeda salsa

2.3 鹽脅迫對不同時期鹽地堿蓬抗壞血酸含量的影響

如圖3所示，抗壞血酸含量隨鹽分梯度增加呈總體下降趨勢，低濃度（小于0.60%）鹽脅迫處理下，苗期鹽地堿蓬抗壞血酸含量高于其他生長時期。在0.90% NaCl處理下，苗期鹽地堿蓬抗壞血酸含量具有最低含量值，為2.55 mg/100 g FW，較對照組差異顯著（P<0.05），降低了45.40%。大于0.30% NaCl濃度時，花期鹽地堿蓬抗壞血酸含量與對照組具有顯著差異（P<0.05），說明苗期和花期鹽地堿蓬抗壞血酸含量對鹽脅迫較敏感。在0.90%與1.20% NaCl處理下，結果期鹽地堿蓬抗壞血酸含量顯著低于對照組（P<0.05），分別下降了17.21%和26.23%。是由于鹽脅迫等逆境加速活性氧的生成，并在體內積累造成氧化傷害，植物體內的抗壞血酸參與活性氧代謝，增強抗逆能力[15]，因此，隨鹽脅迫程度增加，抗壞血酸含量有所減少。

圖3 鹽脅迫對鹽地堿蓬抗壞血酸含量的影響Fig.3 Effect of salt stress on the content of ascorbic acid of Suaeda salsa

2.4 鹽脅迫對不同時期鹽地堿蓬蛋白質含量的影響

圖4 為不同鹽分處理下不同生長時期鹽地堿蓬蛋白質含量變化情況，由圖可知，不同鹽分組的苗期、花期及結果期堿蓬蛋白質含量均差異顯著（P<0.05），花期的鹽地堿蓬中蛋白質含量最高，結果期含量最低。

圖4 鹽脅迫對鹽地堿蓬蛋白質含量的影響Fig.4 Effect of salt stress on the content of protein of Suaeda salsa

鹽地堿蓬蛋白質含量在不同生長時期隨鹽分梯度增加呈現總體波動下降的趨勢。在0.60% NaCl處理下，苗期、花期和結果期鹽地堿蓬蛋白質含量均為最高，分別為27.95、45.58和19.34 mg/g鮮重（FW），較對照組差異不顯著（P>0.05）；當NaCl濃度大于0.60%時蛋白質含量下降，在1.20% NaCl濃度時顯著低于對照組（P<0.05）。一般認為，鹽脅迫會增強植物細胞中的蛋白質合成代謝活動，從而增強滲透調節，促進植物適應鹽脅迫環境[16]，當鹽脅迫超過一定水平會影響到細胞膜的保護作用，進而抑制細胞內正常的生理反應，改變植物體自身的滲透脅迫和離子效應功能[17]。王昊等[18]的研究表明，隨著NaCl濃度的升高翅堿蓬中蛋白質和抗壞血酸含量呈先增加后減少的趨勢。與本研究結果大致相同，因此，當高濃度（大于0.60%）鹽脅迫時，會通過抑制蛋白質的合成和積累來適應逆境。

2.5 鹽脅迫對不同時期鹽地堿蓬氨基酸含量的影響

鹽脅迫會誘導植物啟動自身物質代謝的變化調節，其中氨基酸的滲透調節作用在提高植物耐鹽性中起重要作用[19]。如圖5所示，結果期的鹽地堿蓬氨基酸含量最高，除0.60% NaCl濃度組以外，與其他生長時期差異顯著（P<0.05）。

圖5 鹽脅迫對鹽地堿蓬氨基酸含量的影響Fig.5 Effect of salt stress on the content of amino acid of Suaeda salsa

苗期與花期鹽地堿蓬氨基酸含量在受到鹽脅迫后的響應趨勢基本一致，在NaCl濃度為0.30%時，苗期和花期的鹽地堿蓬氨基酸含量最低，均較對照組差異顯著（P<0.05），分別降低了51.27%和32.03%；在NaCl濃度為0.60%時，花期鹽地堿蓬氨基酸含量最高，為134.26 μmol/g FW，顯著高于對照組（P<0.05）。

隨NaCl濃度增加，結果期鹽地堿蓬氨基酸含量先下降再上升，當NaCl濃度在0.60%時，結果期的鹽地堿蓬氨基酸含量具有最低值，顯著低于對照組及其他試驗組（P<0.05），當NaCl濃度在1.20%時達到最高值，為312.96 μmol/g FW，顯著高于對照組及其他試驗組（P<0.05），試驗結果與鹽處理下番茄嫁接苗葉片和根系中總氨基酸含量顯著提升[20]的研究結果一致，表明鹽分在一定程度上可促進鹽地堿蓬氨基酸的形成和積累，在緩解鹽脅迫傷害中起重要的滲透調節作用。

2.6 鹽脅迫對不同時期鹽地堿蓬亞硝酸鹽含量的影響

亞硝酸鹽作為蔬菜食用安全性的重要指標，根據國家食品安全標準（GB 2762-2017），含量應該在20 mg/kg[8]范圍以內。由圖6可知，所有鹽地堿蓬亞硝酸鹽含量均符合國家標準，其中花期鹽地堿蓬亞硝酸鹽含量最低，均低于1.20 mg/kg FW，而且隨NaCl濃度的增加變化幅度不明顯。隨NaCl濃度增加，苗期鹽地堿蓬亞硝酸鹽含量呈先上升再下降的趨勢，在0.30% NaCl濃度時，亞硝酸鹽含量上升幅度極小，較對照組差異不顯著（P>0.05）；在0.90% NaCl濃度時含量最高，為7.09 mg/kg FW，顯著高于對照組及其他試驗組（P<0.05），當NaCl濃度在高于0.90%后，亞硝酸鹽含量隨NaCl濃度增加有所減少。結果期的鹽地堿蓬亞硝酸鹽含量隨NaCl濃度增加總體有下降的趨勢，在NaCl濃度為1.20%時亞硝酸鹽含量最低，較對照組及其他試驗組差異顯著（P<0.05）。不同生長階段鹽地堿蓬中亞硝酸鹽的差異性可能受到植物在不同生長期對氮元素吸收能力的內部因素以及溫度、水分等外部環境的影響。

圖6 鹽脅迫對鹽地堿蓬亞硝酸鹽含量的影響Fig.6 Effect of salt stress on the content of nitrite of Suaeda salsa

2.7 鹽脅迫與鹽地堿蓬總黃酮含量

2.7.1 鹽地堿蓬總黃酮提取工藝優化 總黃酮提取條件正交試驗結果見表2，可以看出提取總黃酮的最佳工藝有兩個，分別是理論最優方案為A2B3C2D4和實際最優方案試驗號6（A2B2C1D4）。A2B2C1D4提取方法得到總黃酮含量為2.35%，其提取含量大于方案A2B3C2D4的提取含量（2.27%）。因此，最優方案A2B2C1D4總黃酮的提取含量最高，即超聲功率500 W，超聲溫度70 ℃，超聲時間25 min，料液比1:60 g/mL。

表2 L16（44）正交試驗回歸結果Table 2 L16(44) The results of orthogonal test regression

2.7.2 HPLC法測定總黃酮含量 HPLC法具有操作簡單、靈敏度高、準確度高等特點，同時蘆丁和總黃酮含量作為指標具有直線相關性，鋁鹽絡合比色法測定總黃酮含量與HPLC法測定蘆丁含量均可單獨應用于成分提取的過程監測[21]。本研究采用HPLC法，測定鹽脅迫下鹽地堿蓬總黃酮含量，并且以蘆丁標準品建立標準曲線，得出計算方程，以便于定量分析鹽地堿蓬中總黃酮含量。回歸方程為y=15467x+1.9（R2=0.997），其中y是總峰面積，x是樣品中總黃酮濃度（以蘆丁計），mg/mL。HPLC法得到鹽地堿蓬的液相出峰圖譜（以CK苗期樣品為例）見圖7。

圖7 CK苗期鹽地堿蓬總黃酮峰圖Fig.7 Peak diagram of total flavonoids of Suaeda salsa at CK seedling stage

2.7.3 鹽脅迫對不同時期鹽地堿蓬總黃酮含量的影響 黃酮類化合物是適應性反應系統，在植物代謝過程中參與植物生態防御，并擔當生殖過程的信使，可以通過調節黃酮類化合物的合成和積累來應對不同的逆境[22]。如圖8所示，花期的鹽地堿蓬總黃酮含量最高，達3.68%，在不同鹽脅迫處理下均與苗期差異顯著（P<0.05）。李巖等[23]的研究表明翅堿蓬總黃酮含量在花期達到最大（14.37 mg/g）。同時，Zhong[24]的試驗也顯示鹽地堿蓬總黃酮的含量在9月最高（67.75 mg/g），不同月份的鹽地堿蓬中總黃酮含量差異顯著，與本研究結果一致。

圖8 鹽脅迫對鹽地堿蓬總黃酮含量的影響Fig.8 Effect of salt stress on the content of total flavonoid of Suaeda salsa

鹽地堿蓬總黃酮含量隨梯度鹽分增加呈波動上升趨勢，在0.90% NaCl處理下，苗期和花期鹽地堿蓬總黃酮含量為最高，分別為1.58%和3.68%，較對照組差異顯著（P<0.05）。在1.20% NaCl濃度時，結果期鹽地堿蓬總黃酮含量具有最高值3.16%，顯著高于對照組（P<0.05）。在受到外界不利環境影響時，很多植物通過提高體內抗氧化物質含量來減輕脅迫引發的活性氧傷害，使其迅速適應鹽脅迫，從而一定濃度鹽分脅迫促進了黃酮化合物的合成[25]。本研究中鹽地堿蓬總黃酮含量與文獻中試驗規律不完全相同[9,26]，其原因可能是植物的耐鹽機理不同從而展現出不同的規律。

3 結論

不同生長時期的鹽地堿蓬組分含量存在明顯差異，其中水分含量差異性最小，亞硝酸鹽差異性最大。苗期鹽地堿蓬水分含量最高，且隨鹽脅迫程度增加呈上升趨勢，在1.20% NaCl處理下達最大值，且與對照間存在顯著差異（P<0.05）。抗壞血酸含量隨鹽脅迫程度增加總體呈下降趨勢，低濃度（小于0.60%）鹽脅迫處理下，苗期抗壞血酸含量最高。蛋白質含量在不同生長時期隨鹽脅迫程度增加呈總體波動下降趨勢，花期鹽地堿蓬蛋白質含量最高，在0.60% NaCl處理下為最大值。花期鹽地堿蓬亞硝酸鹽含量最低，在0.60% NaCl處理下顯著低于對照組及其他試驗組（P<0.05）。結果期鹽地堿蓬氨基酸含量最高，隨鹽脅迫增加先下降再上升，在1.20%NaCl處理下達最高值，顯著高于對照組及其他試驗組（P<0.05）。采用正交試驗得到總黃酮優化的提取條件：超聲功率500 W，超聲溫度70 ℃，超聲時間25 min，料液比1:60 g/mL，在0.90% NaCl處理下，花期的鹽地堿蓬總黃酮含量最高，達3.68%。

綜上所述，本研究優化形成了一套提取和檢測鹽地堿蓬總黃酮含量的方法，探究了不同濃度鹽脅迫對不同生長時期的鹽地堿蓬組分含量的影響，明確了適宜發展優質安全鹽地堿蓬的土壤鹽分范圍，為鹽地堿蓬質控栽培和合理開發提供技術支撐和理論依據。鹽地堿蓬為強耐鹽植物，可進一步增加鹽脅迫的濃度，探究高鹽分對各組分的影響，對于不同鹽脅迫處理的不同時期鹽地堿蓬中黃酮類化合物的種類以及耐鹽性差異的機理有待進一步研究。