鉤吻素己對(duì)NMDA受體的抑制作用

彭凌峰,楊 杰,孫志良

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410125；3.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

精神疾病在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究備受關(guān)注。喹啉酸是色氨酸的代謝物，是N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受體內(nèi)源性激動(dòng)劑和遞質(zhì)候選物。大腦中隨著喹啉酸濃度的升高，NMDA受體興奮性增加而導(dǎo)致阿茲海默癥、自閉癥、精神分裂等精神疾病[1-2]。同時(shí)NMDA受體與神經(jīng)性疼痛傳導(dǎo)也有關(guān)[3]。NMDA受體分為NMDA1型(NR1)和NMDA2型(NR2)，NMDA1型是構(gòu)成離子通道的基本單位，NMDA2型是調(diào)節(jié)單位。而NMDA2型又分為2A、2B、2C、2D四種亞型。其中N-甲基-D-天冬氨酸ζ1(N-methyl-D-aspartic acid receptor ζ1，NMDAζ1)屬于NMDA1，N-甲基-D-天冬氨酸ε2(N-methyl-D-aspartic acid receptor ε2，NMDAε2)為NMDA2B。

應(yīng)用NMDA受體治療精神疾病的化學(xué)藥物有很多，例如：非氨酯(Felbamate)、地佐環(huán)平(Dizocilpine)、氯胺酮、鹽酸普魯卡因、L-701324等。這些化學(xué)藥物在治療精神疾病的同時(shí)，往往伴隨著不良反應(yīng)的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥有效功能成分在治療精神疾病方面副作用小，效果好。中草藥功能成分在精神疾病方面的研究和應(yīng)用受到越來(lái)越多的關(guān)注[4]。

鉤吻是一種草本植物，具有許多藥理作用,如抗炎、抗焦慮、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、促生長(zhǎng)等[5-6]。鉤吻醇提物中有多種生物堿，其中鉤吻素甲、鉤吻素子和鉤吻綠堿具有明顯的抗焦慮的能力[7]，鉤吻素己能有效減輕神經(jīng)性疼痛和炎癥性疼痛[8]。鉤吻素己減輕疼痛的機(jī)制尚未清楚，本試驗(yàn)研究鉤吻素己對(duì)NMDA受體的抑制作用，為探究鉤吻素己減輕疼痛的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清(FBS)，購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；高糖培養(yǎng)基(DMEM)，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；高效RIPA裂解液[RIPA buffer(high)]、噻唑藍(lán)(MTT),均購(gòu)自北京Solarbio公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自康為世紀(jì)公司；蛋白一抗：NMDAζ1、p-NMDAζ1(Ser896)、NMDAε2、p-NMDAε2(Tyr1474)、β-actin和相應(yīng)二抗，均購(gòu)自Abbkine公司；ECL超敏化學(xué)發(fā)光顯影液，購(gòu)自Proteintech公司；5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要藥物 標(biāo)準(zhǔn)品鉤吻素己(Gelsenicine，純度≥ 98%)，購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品喹啉酸(Quinolinic acid，純度≥ 99%)、地佐環(huán)平(Dizocilpine，純度≥ 99%)，均購(gòu)自美國(guó)Abmole公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) Neuro-2a小鼠神經(jīng)母瘤細(xì)胞，購(gòu)自上海百慷生物技術(shù)股份有限公司。取Neuro-2a細(xì)胞用含有10% FBS的完全培養(yǎng)基于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行消化、傳代。

1.3.2 MTT檢測(cè)Neuro-2a細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Neuro-2a細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，濃度為5 × 104個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96孔板。組一中添加鉤吻素己(濃度為1 600、800、400、200、100、50、25、12.5 μmol/L和6.25 μmol/L)，對(duì)照組加入培養(yǎng)基。組二中添加喹啉酸(濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L和1.563 μmol/L)，對(duì)照組加入培養(yǎng)基。組三中添加喹啉酸(15 μmol/L)+鉤吻素己(濃度為400、200、100、50、25、12.5、6.25 μmol/L和3.125 μmol/L)，對(duì)照組為喹啉酸(15 μmol/L)。組四中添加喹啉酸(15 μmol/L)+地佐環(huán)平(濃度為400、200、100、50、25、12.5、6.25 μmol/L和3.125 μmol/L)，對(duì)照組為喹啉酸(15 μmol/L)。組一、組二和組四藥物作用24 h，組三藥物作用12、24 h和48 h。所有試驗(yàn)組藥物作用一定時(shí)間后，每孔加入MTT溶液，37 ℃孵育4 h。隨后加入二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值(A)。計(jì)算細(xì)胞活力度，每組試驗(yàn)均重復(fù)3次(n=3)。

1.3.3 EdU細(xì)胞增殖檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Neuro-2a細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，濃度為5 × 104個(gè)/mL，接種在96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，加入藥物孵育。組一中添加鉤吻素己(濃度為0、100 μmol/L和200 μmol/L)。組二中添加喹啉酸(15 μmol/L)+鉤吻素己(濃度為0、100 μmol/L和200 μmol/L)。組三中添加喹啉酸(15 μmol/L)+地佐環(huán)平(濃度為0、25 μmol/L和50 μmol/L)。藥物孵育24 h后，加入等體積EdU工作液繼續(xù)孵育2 h。然后經(jīng)過固定、洗滌、通透、洗滌后，加入Click反應(yīng)液避光孵育30 min。洗滌后加入1×Hoechst 33342溶液，孵育10 min。洗滌后進(jìn)行熒光檢測(cè)[9]。使用Image J軟件進(jìn)行熒光信號(hào)強(qiáng)度(MFI)檢測(cè)，然后計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例即為細(xì)胞增殖率。每組試驗(yàn)均重復(fù)3次(n=3)。

1.3.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Neuro-2a細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，濃度為10×104個(gè)/mL。組一為鉤吻素己(濃度為0、50、100 μmol/L和200 μmol/L)、組二為喹啉酸(濃度為0、10 μmol/L和15 μmol/L)、組三為喹啉酸(15 μmol/L)+鉤吻素己(濃度為0、50、100 μmol/L和200 μmol/L)、組四為喹啉酸(15 μmol/L)+地佐環(huán)平(濃度為0、25 μmol/L和50 μmol/L)。藥物作用24 h后，提取細(xì)胞蛋白。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene flouride，PVDF)膜上。封閉液封閉1 h，加入稀釋好的NMDAζ1、p-NMDAζ1(Ser896)、NMDAε2、p-NMDAε2(Tyr1474)和β-actin(比例均為1∶500)一抗，4 ℃孵育過夜。用吐溫20/三乙醇胺緩沖鹽水溶液(Tween20/Tris-buffered saline，TBST)清洗PVDF膜后，加入稀釋好的二抗(比例為1∶10 000)。室溫?fù)u動(dòng)孵育2 h后，用TBST緩沖液清洗。將膜置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中，均勻滴加ECL化學(xué)發(fā)光顯影液，避光孵育2 min后開始顯影。每組試驗(yàn)均重復(fù)3次(n=3)。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)Neuro-2a細(xì)胞活性 鉤吻素己和喹啉酸分別作用Neuro-2a細(xì)胞24 h后，鉤吻素己在100～800 μmol/L時(shí)可增強(qiáng)細(xì)胞活力，其中100 μmol/L的效果最好(P<0.05)。結(jié)果表明鉤吻素己對(duì)Neuro-2a細(xì)胞的半抑制濃度(Half maximal inhibitory concentration，IC50)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1 600 μmol/L(圖1A)，而喹啉酸對(duì)Neuro-2a細(xì)胞的IC50為15 μmol/L(圖1B)。

圖1 鉤吻素己(A)和喹啉酸(B)對(duì)Neuro-2a細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of gelsenicine(A)and quinolinic acid(B)on the viability of Neuro-2a cells與對(duì)照組比較，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，n=3；下圖同Compare to control group,*：P<0.05,**：P<0.01,***：P<0.001,n=3.The same as below

鉤吻素己(400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L和0 μmol/L)和15 μmol/L喹啉酸共處理細(xì)胞12 h(圖2A)、24 h(圖2B)、48 h(圖2C)，結(jié)果顯示鉤吻素己能有效減弱喹啉酸對(duì)于細(xì)胞活性的抑制作用。當(dāng)鉤吻素己濃度為200 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組(0 μmol/L)比較，細(xì)胞活力度增加10%(P<0.01)(圖2B)。地佐環(huán)平是NMDA受體的一種非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑。不同濃度的地佐環(huán)平和喹啉酸同時(shí)作用細(xì)胞24 h后，結(jié)果顯示地佐環(huán)平對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)效果。當(dāng)?shù)刈舡h(huán)平作用濃度為50 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組(0 μmol/L)相比，細(xì)胞活力度提高了10%(P<0.05)(圖2D)。

圖2 鉤吻素己、地佐環(huán)平對(duì)喹啉酸處理的Neuro-2a細(xì)胞活力影響Fig.2 Effect of gelsenicine and dizocilpine on the viability of quinolinic acid-treated Neuro-2a cellsA：鉤吻素己和喹啉酸處理12 h；B：鉤吻素己和喹啉酸處理24 h；C：鉤吻素己和喹啉酸處理48 h；D：地佐環(huán)平和喹啉酸處理24 hA:Gelsenicine and quinolinic acid treated for 12 h;B:Gelsenicine and quinolinic acid treated for 24 h;C:Gelsenicine and quinolinic acid treated for 48 h;D:Dizocilpine and quinolinic acid treated for 24 h

2.2 EdU檢驗(yàn)鉤吻素己對(duì)細(xì)胞增殖的影響 EdU試驗(yàn)檢測(cè)鉤吻素己作用細(xì)胞24 h后，細(xì)胞增殖情況。200 μmol/L鉤吻素己作用Neuro-2a細(xì)胞24 h后，EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例增加(P<0.05)(中插彩版圖3B)，即Neuro-2a細(xì)胞增殖率增加，說明鉤吻素己能夠促進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞增殖。

圖3 鉤吻素己對(duì)Neuro-2a細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of gelsenicine treatment on the proliferation of Neuro-2a cellsA：熒光顯微鏡觀察結(jié)果(100 ×)；B：EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例分析統(tǒng)計(jì)A:Fluorescence microscope observe result(100 ×);B:EdU positive cells rate analysis and statistics

2.3 EdU檢驗(yàn)鉤吻素己、地佐環(huán)平對(duì)喹啉酸作用下的細(xì)胞增殖影響 100 μmol/L鉤吻素己+15 μmol/L喹啉酸試驗(yàn)組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05)(中插彩版圖4C)。50 μmol/L地佐環(huán)平+15 μmol/L喹啉酸試驗(yàn)組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例略有增加(P>0.05)(中插彩版圖4D)。結(jié)果表明鉤吻素己明顯降低了喹啉酸抑制Neuro-2a細(xì)胞增殖的能力。

圖4 鉤吻素己、地佐環(huán)平對(duì)喹啉酸處理Neuro-2a細(xì)胞增殖的影響(100×)Fig.4 Effect of gelsenicine and dizocilpine on the proliferation of quinolinic acid-treated Neuro-2a cells (100 ×)A:鉤吻素己+喹啉酸組熒光顯微鏡觀察結(jié)果；B:地佐環(huán)平+喹啉酸組熒光顯微鏡觀察結(jié)果；C:鉤吻素己+喹啉酸組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例；D:地佐環(huán)平+喹啉酸組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例A:Fluorescence microscope observe result of gelsenicine + quinolinic acid group;B:Fluorescence microscope observe result of dizocilpine + quinolinic acid group;C:EdU positive cells rate of gelsenicine + quinolinic acid group;D:Edu positive cells rate of dizocilpine + quinolinic acid group

2.4 Western Blot檢測(cè)鉤吻素己對(duì)NMDA受體的影響 結(jié)果顯示，鉤吻素己能降低p-NMDAε2(Tyr1474)水平和NMDAε2蛋白的表達(dá)(P<0.05)，表明鉤吻素己能夠抑制NMDAε2受體活性。如圖5所示，當(dāng)鉤吻素己濃度為200 μmol/L時(shí)，NMDAζ1蛋白表達(dá)量和對(duì)照組(0 μmol/L)相比基本沒有變化(P>0.05)，但是降低了p-NMDAζ1(Ser896)水平(P<0.001)，使得NMDAζ1蛋白活性降低。表明鉤吻素己能夠有效抑制NMDA受體活性。

圖5 鉤吻素己對(duì)NMDAζ1和NMDAε2蛋白表達(dá)及其磷酸化作用的影響Fig.5 Effect of gelsenicine on protein expression and phosphorylation of NMDAζ1 and NMDAε2A：蛋白灰度條帶；B：蛋白表達(dá)分析統(tǒng)計(jì)A:Protein grayscale band;B:Protein expression analysis and statistics

2.5 Western Blot檢測(cè)鉤吻素己、喹啉酸對(duì)NMDA受體的影響 結(jié)果顯示，喹啉酸提高了p-NMDAε2(Tyr1474)水平(P<0.05)，NMDAε2蛋白活性增加。同時(shí)引起p-NMDAζ1(Ser896)水平增加(P<0.05)，增加NMDAζ1蛋白活性(圖6A)。鉤吻素己能夠抑制喹啉酸引起的p-NMDAε2(Tyr1474)水平增加，p-NMDAε2(Tyr1474)水平隨鉤吻素己濃度的增加而降低(P<0.05)。當(dāng)鉤吻素己濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)，p-NMDAε2(Tyr1474)水平明顯減少(P<0.01)，NMDAε2表達(dá)量明顯受抑制。NMDAε2蛋白表達(dá)量隨鉤吻素己濃度的增加而減少，p-NMDAζ1(Ser896)水平和NMDAζ1蛋白表達(dá)量也相應(yīng)減少(P<0.05)(圖6B)。25 μmol/L地佐環(huán)平和15 μmol/L喹啉酸同時(shí)作用Neuro-2a細(xì)胞時(shí)，p-NMDAε2(Tyr1474)水平降低(P<0.05)，而NMDAε2表達(dá)量基本沒有變化。同時(shí)p-NMDAζ1(Ser896)水平也相應(yīng)的減少(P<0.01)，但NMDAζ1蛋白的表達(dá)量相對(duì)基本不變，NMDAζ1蛋白活性降低(圖6C)。

圖6 鉤吻素己和地佐環(huán)平對(duì)喹啉酸處理的Neuro-2a細(xì)胞中NMDAζ1和NMDAε2蛋白表達(dá)及其磷酸化作用的影響Fig.6 Effect of gelsenicine and dizocilpine on protein expression and phosphorylation of NMDAζ1 and NMDAε2 in quinolinic acid-treated Neuro-2a cellsA:喹啉酸組蛋白灰度條帶；B:鉤吻素己+喹啉酸組蛋白灰度條帶；C:地佐環(huán)平+喹啉酸組蛋白灰度條帶;D:喹啉酸組蛋白表達(dá)分析統(tǒng)計(jì)；E:鉤吻素己+喹啉酸組蛋白表達(dá)分析統(tǒng)計(jì)；F:地佐環(huán)平+喹啉酸組蛋白表達(dá)分析統(tǒng)計(jì)A:Protein grayscale band of quinolinic acid group;B:Protein grayscale band of gelsenicine + quinolinic acid group;C:Protein grayscale band of dizocilpine + quinolinic acid group;D:Protein expression analysis and statistics of quinolinic acid group;E:Protein expression analysis and statistics of gelsenicine + quinolinic acid group;F:Protein expression analysis and statistics of dizocilpine + quinolinic acid goup

3 討論

疼痛等神經(jīng)信號(hào)的傳遞，往往伴隨著神經(jīng)遞質(zhì)在受體間的傳遞。喹啉酸是NMDA受體內(nèi)源性激動(dòng)劑，它對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的毒性主要通過激動(dòng)NMDA受體，使細(xì)胞外Ca2+大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外電位發(fā)生變化。Ca2+使細(xì)胞內(nèi)電荷過載以此激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡基因，引發(fā)細(xì)胞的凋亡[10-11]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鉤吻素己對(duì)Neuro-2a細(xì)胞正常生長(zhǎng)幾乎沒有毒性；當(dāng)鉤吻素己和喹啉酸同時(shí)加入時(shí)，鉤吻素己能保護(hù)Neuro-2a細(xì)胞，拮抗喹啉酸毒性效果。

NMDAε2(即NR2B)是NMDA2受體多種亞型中的一種，有多樣性調(diào)節(jié)功能。NMDAε2受體與抑郁、記憶障礙和缺陷、神經(jīng)性運(yùn)動(dòng)等相關(guān)[12]，也是神經(jīng)性疼痛的參與者，在脊髓水平上對(duì)神經(jīng)性疼痛的發(fā)展起重要作用[13]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，鉤吻素己能夠有效減少NMDAε2蛋白的表達(dá)，降低p-NMDAε2(Tyr1474)水平。同時(shí)降低p-NMDAζ1(Ser896)水平，有效抑制NMDAζ1受體活性。鉤吻素己的鎮(zhèn)痛效果，可能是通過降低p-NMDAε2(Tyr1474)水平和NMDAε2蛋白表達(dá)來(lái)調(diào)控NMDAζ1受體，降低NMDAζ1活性，減少細(xì)胞膜內(nèi)外離子的進(jìn)出，進(jìn)而減弱膜內(nèi)外電荷轉(zhuǎn)變引起的電信號(hào)傳遞。預(yù)示著NMDAε2受體可能是鉤吻素己另外一種潛在的鎮(zhèn)痛途徑。

鉤吻素己是中草藥單體成份，在機(jī)體內(nèi)代謝快，不易產(chǎn)生長(zhǎng)期用藥后的依賴性[14]。地佐環(huán)平作為一種精神類藥物，也是NMDA受體的一種拮抗劑，在治療抑郁和止痛等病癥中發(fā)揮作用[15]。由于喹啉酸是NMDA受體一種內(nèi)源性激動(dòng)劑和遞質(zhì)候選物質(zhì)，而地佐環(huán)平作為一種精神類藥物。本試驗(yàn)選擇地佐環(huán)平作為一種陽(yáng)性對(duì)照藥物，研究鉤吻素己對(duì)NMDA受體的影響。地佐環(huán)平能有效降低NMDAζ1活性，但不影響NMDAζ1蛋白表達(dá)[16]。鉤吻素己能降低p-NMDAζ1(Ser896)和p-NMDAε2(Tyr1474)水平，但NMDAζ1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。在喹啉酸作用下，鉤吻素己能夠降低NMDAε2蛋白表達(dá)，而地佐環(huán)平不能。地佐環(huán)平與喹啉酸同時(shí)作用時(shí)，NMDAζ1蛋白表達(dá)不會(huì)減少，但鉤吻素己與喹啉酸同時(shí)作用能引起NMDAζ1蛋白表達(dá)減少。鉤吻素己和地佐環(huán)平都能有效的降低NMDAζ1和NMDAε2兩種蛋白的活性。

鉤吻素己能夠通過降低p-NMDAε2(Tyr1474)水平抑制NMDAε2蛋白活性，以及抑制NMDA受體中NMDAζ1蛋白活性。通過抑制NMDA受體活性，有效降低喹啉酸對(duì)Neuro-2a細(xì)胞的活性抑制，促進(jìn)細(xì)胞增殖。預(yù)示著鉤吻素己可能成為一種有效拮抗NMDA受體蛋白活性的潛在前體類藥物。

鉤吻素己能夠有效抑制NMDA受體活性，但是鉤吻素己作用于NMDA受體是競(jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制并沒有得到有效的驗(yàn)證，這需要未來(lái)進(jìn)一步試驗(yàn)研究。