復方靈芝對小鼠鎮靜催眠作用的研究及機制初探

陳春玲，梁大紅，田 佳，陳文雙，張新樂，許碧蓮，許衛銘，吳 鐵，陳光華

(1.廣東醫科大學藥學院，廣東 湛江 524023;2.廣東醫科大學附屬醫院，廣東 湛江 524023)

失眠在臨床醫學上稱為“睡眠障礙”，睡眠障礙指睡眠-覺醒過程中表現出來的各種功能障礙，導致睡眠質量下降[1]。睡眠障礙還可以導致器官功能的改變，如認知功能、免疫功能、內分泌功能等[2]。治療失眠癥最常用且有效的方法是應用苯二氮卓類和巴比妥類藥物，由于安全性低，巴比妥類藥物已逐漸退出鎮靜催眠藥市場，依然活躍在市場的苯二氮卓類藥物因為潛在的藥物依賴性仍屬精神藥品管理范圍，處方受限制[3]。所以，研發無毒副作用的鎮靜催眠類食品尤為必要。靈芝(Ganodermalucidum,GL)用于治療失眠已有數百年歷史[4]，本試驗復方靈芝是以赤靈芝為主藥的基礎上，輔以同樣具有安神效果的茯苓、酸棗仁組成中藥復方，進一步驗證其鎮靜催眠效果并初步探討機制。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品 (1)復方靈芝：由赤靈芝、茯苓、酸棗仁三味中藥組成，試驗時用蒸餾水加熱提取10 min，濃縮到42%，備用。(2)陽性對照藥：艾司唑侖(山東信誼制藥有限公司，批號:151214)，試驗時用蒸餾水配制成1.3%的水溶液備用。(3)戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號：WS20060401)，各濃度戊巴比妥鈉溶液的溶劑為蒸餾水。(4)小鼠γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司，批號：201607),谷氨酸(Glutamate，Glu)ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司，批號：201607)，谷氨酰胺(Glutamine，Gln)ELISA檢測試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司，批號：201607)，5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司，批號：201607)，5-羥色胺(5-HT)ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司，批號：201607)。

1.2 實驗動物 SPF級昆明小鼠60只，雄性，體重26～30 g，由廣東醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2015—0147，實驗動物生產許可證號：SCXK(粵)2013—0008。各動物在常溫安靜動物室環境下正常飼養。

1.3 主要儀器 玻璃勻漿器，高速冷凍離心機YY/T0657-2008(湖南赫西儀器公司)，全自動酶標儀VT05404-0998(美國伯騰儀器公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1 閾下劑量戊巴比妥鈉協同作用下復方靈芝的鎮靜催眠作用 30只小鼠試驗前在實驗室適應性喂養7 d后，隨機分為3組：空白對照組、陽性藥物組、復方靈芝組，每組10只，分別給予蒸餾水、0.13%艾司唑侖水溶液、復方靈芝水提液，除復方靈芝水提液每天0.3 mL/(10 g·bw)灌胃，其余每天0.2 mL/(10 g·bw)灌胃。連續給藥8 d，在第7天給藥灌胃給予對應藥物60 min后，按參考文獻[5]方法，考察30 min內入睡小鼠只數(翻正反射消失1 min 以上)。

1.4.2 閾上劑量戊巴比妥鈉協同作用下復方靈芝的鎮靜催眠作用 30只小鼠按“1.4.1”項下分組方法及給藥劑量，末次給藥60 min后，各組小鼠分別腹腔注射閾上劑量戊巴比妥鈉[40 mg/(kg·bw)，0.1 mL/(10g·bw)，參考文獻[5] 和預試驗結果]。記錄小鼠的睡眠潛伏期及睡眠持續時間。

1.4.3 復方靈芝對失眠模型小鼠腦組織Gln、Glu、GABA、5-HIAA 和5-HT含量的影響 各組小鼠在第8天末次給藥60 min后給予閾劑量戊巴比妥鈉，禁食12 h，將所有小鼠斷頸處死，迅速取出小鼠腦組織，用生理鹽水沖洗后稱質量，用勻漿器制備10%的腦組織勻漿，-4 ℃ 3 000 r/min離心10 min后取上清液，于-20 ℃低溫保存。采用ELISA按照試劑盒說明書進行測量，測定各組小鼠腦組織中Gln、Glu、GABA、5-HIAA 和5-HT的含量。

2 結果

2.1 閾下劑量戊巴比妥鈉協同作用下復方靈芝的鎮靜催眠作用 與空白對照組比較，復方靈芝組和陽性藥物組小鼠入睡率極顯著提高(P<0.01)。

表1 閾下催眠劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠入睡情況比較Table 1 Comparison of sleep induced by pentobarbital sodium at subthreshold hypnotic dose in mice (n=10)

2.2 閾上劑量戊巴比妥鈉協同作用下復方靈芝的鎮靜催眠作用 與空白對照組比較，復方靈芝組和陽性藥物組睡眠潛伏期明顯縮短，陽性藥物組睡眠持續時間明顯延長，差異極顯著(P<0.01)，復方靈芝組睡眠持續時間延長不明顯(P>0.05)。結果見圖1。

圖1 閾劑量戊巴比妥鈉對各組小鼠睡眠的影響Fig.1 Effect of threshold dose pentobarbital sodium on sleep in miceA:睡眠潛伏期;B:睡眠持續時間A:Sleep incubation period;B:Duration of sleep

2.3 復方靈芝對失眠模型小鼠腦組織Gln、Glu和GABA含量的影響 各組小鼠在第8天末次給藥60 min 后給予閾劑量戊巴比妥鈉，禁食12 h，將所有小鼠斷頭處理，迅速取出小鼠腦組織，用勻漿器制備10%的腦組織勻漿，采用酶聯免疫吸附法按照試劑盒說明書進行測量，測定各組小鼠腦組織中Gln、Glu和GABA含量。與空白對照組比較，復方靈芝組小鼠腦內GABA含量增加，差異極顯著(P<0.01)；陽性藥物組、復方靈芝組的Glu和Gln含量均減少，差異極顯著(P<0.01)。結果見圖2。

圖2 藥物對小鼠腦組織中GABA、Glu及Gln的影響Fig.2 Effects of drugs on GABA,Glu and Gln in mouse brain tissueA：GABA；B：Glu；C：Gln

2.4 復方靈芝對失眠模型小鼠腦組織5-HIAA 和5-HT含量的影響 小鼠腦組織取樣同上，然后采用酶聯免疫吸附法按照試劑盒說明書進行測量，測定各組小鼠腦組織中5-HT和5-HIAA含量。與空白對照組比較，陽性藥物組的5-HT含量增加，差異極顯著(P<0.01)；但HIAA含量無明顯變化。復方靈芝組的5-HT及5-HITT含量均無明顯變化。結果見圖3。

圖3 藥物對小鼠腦組織中5-HT及5-HITT的影響Fig.3 Effects of drugs on 5-HT and 5-HITT in mouse brain tissueA：5-HT；B：5-HITT

3 討論

本試驗結果表明，復方靈芝不但能顯著縮短閾劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠的睡眠潛伏期，而且能提高閾下劑量戊巴比妥鈉誘導的小鼠入睡率。復方靈芝導致閾下劑量的戊巴比妥鈉小鼠入睡的只數與陽性藥物組相當，無統計學意義；對閾劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間的作用不及陽性藥物。結果提示，復方靈芝能協同戊巴比妥鈉縮短入睡時間，延長睡眠時間，可用于入睡困難、反復易醒的失眠病人，有明顯的鎮靜、催眠作用。

復方靈芝君藥為靈芝，靈芝為擔子菌綱靈芝屬真菌，東漢《神農本草經》將靈芝列為上品，《中華人民共和國藥典》收載靈芝(赤芝、紫芝)子實體為法定中藥材。2000年版《美國草藥藥典和治療概要》收載了靈芝。現代醫學證明,靈芝含有多種生理活性物質,對人體免疫系統、中樞神經系統等具有良好的功效作用；研究已經證明，靈芝具有鎮靜、催眠等對神經系統的藥理作用[4]，靈芝的改善睡眠作用是通過其中的靈芝多糖調節神經系統，從而影響松果體對褪黑素的分泌[6]，靈芝多糖還可以明顯提高超氧化物歧化酶(SOD)活性[7],促進H2O2的清除,對羥自由基有清除作用,可明顯清除機體產生的自由基,阻止自由基對機體的損傷,降低機體的疲勞感，因而,抗氧化作用可能是靈芝改善睡眠的作用機制之一；另外，靈芝對中樞神經系統有明顯的鎮靜作用,能使動物的肌肉輕度松弛,自發性活動減少,還能協同巴比妥類藥物的中樞抑制作用，但靈芝本身并無催眠作用，這也可能是靈芝改善睡眠原因之一。茯苓和酸棗仁皆為臣藥，茯苓為多孔菌科臥菌屬真菌的干燥菌核，是一種常用中藥，始載于《本草經》，味甘淡，性平，有健脾補中、養心安神、利水滲濕的功能[8]。還有報道[9]顯示，茯苓水提液可以改善東莨菪堿所致記憶獲得障礙和30%乙醇所致記憶再現障礙2種模型小鼠的學習記憶能力。茯苓的抗驚厥和催眠作用機制[10]可能與增加GABA的表達和下調谷氨酸和天冬氨酸的水平有關。酸棗仁是鼠李科植物酸棗的種子成熟后經過干燥處理所得，其性平，味甘、酸，歸肝、膽、心經，具有養肝、寧心安神、斂汗的功效[11]。酸棗仁是臨床很常用的治療失眠的中藥，長期用于改善睡眠療效顯著[12]。最近的藥理學研究確認，酸棗仁主要是通過改變5-HT 和GABA含量來影響睡眠，最終達到鎮靜催眠的效果。

Glu和GABA是中樞神經系統(CNS)中2種主要的氨基酸，GABA是CNS中最主要的抑制性遞質，而Glu在CNS含量較高，是興奮性遞質。巴比妥類藥物和抗癲癇藥苯妥英鈉均能增加GABA的神經功能，其機制可能與促進腦內GABA釋放有關。為了初步探討紫靈芝中樞抑制作用機制，本試驗采用酶聯免疫法測定了小鼠腦組織中GABA、Glu的含量，將神經遞質的主要來源物質Gln作為觀測指標。結果表明：復方靈芝明顯提高小鼠腦組織中GABA的含量，降低小鼠腦組織中Glu及Gln的含量，提示該藥的鎮靜催眠作用可能與增加CNS中GABA含量、減少Glu含量有關。提示藥物可能通過增加抑制性遞質GABA合成和增加興奮性遞質Glu代謝而起到中樞抑制的作用。但復方靈芝通過何種途徑減少興奮性神經遞質Glu的含量增加抑制性遞質的含量，是否與GABA受體有關還有待進一步研究。

臨床資料顯示，失眠患者也常伴有中樞神經遞質5-HT 的降低，5-HT是參與了非快動眼睡眠時相，從而影響睡眠。而口服5-HT前體5-HTP后，5-HT含量增加，可促進睡眠。5-HT經代謝可生成5-HIAA，5-HIAA 的變化也可間接反映5-HT的變化。結果表明，而復方靈芝組小鼠腦內5-HT、5-HIAA 含量無明顯變化，提示其作用機制與5-HT、5-HIAA的合成無關，對非快動眼睡眠時相無影響。

綜上所述，復方靈芝有明顯的鎮靜、催眠作用。可能通過增加中樞抑制性遞質GABA合成和增加興奮性遞質Glu代謝而起到中樞抑制的作用。