多黏菌素抗性基因mcr-4/5/8實時熒光定量PCR檢測方法的建立

李一鳴，王少林

(中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193)

抗生素是目前臨床上治療感染性疾病的重要武器之一，但隨著抗生素在臨床及畜禽生產上的重復使用，耐藥菌的種類和數量都在逐年上升，臨床上不僅出現了多重耐藥菌(Multi-drug resistant bacteria，MDR)、廣泛耐藥菌(Extensively drug resistant，XDR)，還出現了泛耐藥菌(Pandrug resistant bacteria，PDR)。一些化合物已經被開發或重新應用于革蘭陽性耐藥菌的治療，但有很大的局限性；而革蘭陰性多重耐藥菌的感染更為可怕，目前臨床上還沒有可用于這些感染的新藥物[1]。多黏菌素是治療多重耐藥革蘭陰性菌最重要的藥物之一，隨著其在人類臨床上的廣泛運用，多黏菌素耐藥基因開始在世界范圍內出現，人類臨床及獸醫臨床面臨著前所未有的危機和挑戰[2]。

目前，多黏菌素耐藥基因mcr在世界各地的動物、食物以及人類的腸桿菌科細菌中均有發現，其中包括了北美洲、北非、南洋和歐洲[3-4]。這類耐藥基因可以在細菌之間通過質粒傳播，加速了多黏菌素耐藥基因的傳播速度，對人類健康和畜牧業生產造成了嚴重的威脅，目前急需一種快速檢測方法，為未知樣品中的mcr基因檢測提供依據。相對于傳統PCR而言，實時熒光定量PCR具有更高的特異性和敏感性，且操作簡便[5-6]。目前，mcr-1/2/3/4/5/8在國內外被多次報道，且具有較高的流行率。本實驗室前期已經構建了mcr-1/2/3的實時熒光定量檢測方法，而mcr-4/5/8的相關方法還未構建，本試驗針對mcr-4/5/8基因建立了相應的實時熒光定量PCR檢測方法，以便于對動物以及環境樣本中多黏菌素耐藥基因進行定性與定量檢測。

1 材料與方法

1.1 模板、樣本和載體mcr-1/2/3/4/5/8陽性模板由中國農業大學動物醫學院基礎獸醫系藥理與毒理研究室保存。24份環境樣本來自 2018 年重慶育肥豬場和蛋雞養殖場，為糞便和土壤樣品。5 份mcr-8 陽性菌液和 3 份mcr-8 陰性菌液來自2018 年青島豬場和雞場，均為肺炎克雷伯菌。感受態細胞DH5α、pMD19-T載體，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑 QIAGEN?Plasmid Mini Kit試劑盒，購自優寶生物科技有限公司；PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒，購自美國MO BIO公司；2×TaqTMPCR Master Mix，購自寶生物工程(大連)有限公司；PowerUPTMSYBR?Green Master Mix 試劑盒，購自美國 Thermo 公司；Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒，購自北京普洛麥格生物技術有限公司。

1.3 主要儀器 熒光定量PCR儀Q7，購自美國ABI公司；NanoDrop，購自美國Thermo公司。

1.4 引物設計和驗證 首先在NCBI上下載試驗中需要的mcr-4/5/8基因的完整序列，使用Primer3plus系統設計本次試驗所需要的實時熒光定量PCR特異性引物(表1)，并查看其特異性，之后再通過傳統PCR的方式對其特異性進行驗證，本次試驗所用引物均由北京博邁德有限公司合成。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers of real-time PCR

1.5 基因克隆 利用所設計的特異性引物分別對mcr-4/5/8陽性模板進行PCR擴增。對擴增后的產物進行凝膠電泳并切膠回收。將高質量的膠回收產物與pMD19-T載體連接，構成重組質粒。將重組質粒轉化到DH5α感受態細胞中，通過藍白斑篩選的方式篩選出成功的轉化子，并對其進行驗證。對轉化成功的細菌純化后進行質粒的提取。

1.6 標準品的制備 使用NanoDrop測定標準質粒的濃度，根據質粒拷貝數計算公式，計算各樣品中重組質粒的拷貝數?？截悢?Copies/mL)=(L×C)/(N×M×109)，L為阿伏伽德羅常數，C為重組質粒濃度，N為目的片段加上載體片段的長度，M為每對堿基的平均分子量(660/bp)。

1.7 標準曲線的建立 對標準品進行10倍梯度稀釋，取不同稀釋度的標準品作為模板。對實時熒光定量PCR反應體系中各組分濃度和退火溫度進行優化，以獲得最低的Ct值和較高的熒光強度增加值。利用優化好的條件通過SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法構建標準曲線。

1.8 方法特異性的檢測 利用建立的方法對1株mcr-4陽性模板、1株mcr-5陽性模板、5株mcr-8陽性菌液以及3株mcr-8陰性菌液(8份菌液為2018年青島豬場和雞場分離的肺炎克雷伯菌)進行盲選，觀察檢測結果是否與之前的測序結果相一致。同時對24份環境樣品(樣本來自2018年重慶育肥豬場和蛋雞養殖場，共24份糞便和土壤樣本)進行檢測，根據檢查結果來判定所建立方法的特異性和靈敏度。

2 結果

2.1 引物設計與驗證 對所設計的mcr-4/5/8引物的特異性進行驗證，結果如中插彩版圖1所示，凝膠電泳圖中陽性孔有且只有1條明亮的條帶，陰性對照未出現條帶；熔解曲線均為單峰，表明設計的引物特異性好，可以用于目的基因的定量檢測。

圖1 mcr-4/5/8引物特異性驗證和熔解曲線Fig.1 Specificity verification of primers and melting curves for mcr-4/5/8M：DNA maker 2 000；A、B、C：mcr-4/5/8；1、2、3、4、5、8：mcr-1/2/3/4/5/8模板；-：陰性對照M：DNA maker 2 000；A，B，C：mcr-4/5/8；1,2,3,4,5,8：mcr-1/2/3/4/5/8 templates；-：Negative control

2.2 重組質粒驗證 將轉入DH5α感受態細胞的重組質粒通過藍白斑篩選的方式，最終成功篩選出白色菌落(轉化子)。使用所設計的特異性引物以及pMD-19T載體引物M13對獲得的轉化子進行驗證，確定重組質粒是否構建成功。通過mcr-4/5/8引物擴增重組質粒產生的目的片段預期大小為184、184 bp和170 bp；M13引物的擴增產物預期長度為314、314 bp和300 bp。如圖2所示，片段大小與預期結果相一致，說明目的基因和T載體成功連接在一起，重組質粒構建成功。

圖2 重組質粒驗證Fig.2 Verification for recombinant plasmidsA：M13引物擴增；B：mcr-4/5/8引物擴增；M：DNA marker 2 000；4、5、8：mcr-4/5/8重組質粒；-：陰性對照A：M13 primer amplification；B：mcr-4/5/8 primers amplification；M：DNA marker 2 000；4,5,8：Recombinant plasmids of mcr-4/5/8；-：Negative control

2.3 標準曲線的構建 使用上述所制備的重組質粒構建標準品，10倍梯度稀釋后構建檢測方法的標準曲線，每個梯度3個平行。由表2可知：標準曲線擴增效率接近100%，R2>0.999。從中插彩版圖3可知，標準曲線的線性關系良好；擴增曲線平滑且平行性良好；熔解曲線Tm呈單峰，反應過程中擴增產物單一。結果表明本次試驗所建立的檢測方法特異性好，可用于實際樣本中多黏菌素耐藥基因mcr-4/5/8的檢測。

表2 熒光定量PCR標準曲線相關數據Table 2 Relevant data of real time PCR standard curve

圖3 mcr-4/5/8熒光定量檢測方法的標準曲線、擴增曲線和熔解曲線Fig.3 Real-time PCR standard curves,amplification curves and melting curves for mcr-4/5/8A：標準曲線；B：擴增曲線；C：熔解曲線A：Standard curves；B：Amplification curves；C：Melting curves

2.4 方法特異性和靈敏度的驗證 對24份環境樣品進行檢測，但樣本中mcr-4/5/8的檢測結果均為陰性，這可能跟mcr-4/5/8基因在國內的流行特征有關。

同時利用所建立的方法對1株mcr-4陽性模板、1株mcr-5陽性模板、5株mcr-8陽性菌液以及3株mcr-8陰性菌液進行盲選，即分別使用所設計的mcr-4/5/8特異性引物對這些模板和菌液進行熒光定量PCR反應，檢測結果見圖4，與之前的測序結果100%相一致，證明本次所構建方法特異性好。

圖4 菌液中mcr-4/5/8基因的檢測Fig.4 Detection of mcr-4/5/8 genes in bacteria4-N/4-P：mcr-4陰性/陽性樣本；5-N/5-P：mcr-5陰性/陽性樣本；8-N/8-P：mcr-8陰性/陽性樣本4-N/4-P:mcr-4 negative/positive samples;5-N/5-P:mcr-5 negative/positive samples;8-N/8-P:mcr-8 negative/positive samples

3 討論

本試驗采用了一種新型的PCR方法——實時熒光定量PCR，即通過向反應體系中加入一定量的SYBR熒光基團，使反應體系隨著基因的擴增增加熒光信號的強度[5]。SYBR熒光基團可以與DNA雙鏈進行特異性結合。只有與DNA雙鏈特異性結合的熒光染料才可以發射出熒光信號，因此，熒光信號的增加和目的基因的增加在整個過程中是完全一致的，由此可實現樣本的定量檢測[6]。相對于傳統PCR來說，具有方便、快捷、準確等優勢[5]。該方法目前應用于各個領域，如臨床疾病診斷、動物疾病檢測、食品安全、科學研究以及相關行業，運用范圍廣泛。

隨著多重耐藥革蘭陰性菌的廣泛增多，多黏菌素在臨床上的使用日益增加。2015 年，多黏菌素耐藥基因mcr-1 在我國首次被報道[7]。2016年，在芬蘭發現了人類臨床上首株攜帶mcr-1 基因的多黏菌素耐藥菌[8]。隨后，mcr基因的各個變異體開始相繼出現(表3)，引起了全世界的廣泛關注。多黏菌素耐藥基因的出現給人類一個嚴重的警告。因此，構建多黏菌素耐藥基因的快速篩選方法十分必要。目前，Li等已經構建了針對mcr-1/2/3的多重實時熒光定量PCR方法，可以從臨床和環境樣本中快速且有效地檢測出耐藥基因[9]。Rebelo等開發了一種用于檢測mcr-1/2/3/4/5的多重PCR方法，可以單獨或組合用于腸桿菌科細菌中的可轉移的多黏菌素抗性基因的檢測[10]。最近，有一篇關于mcr-8基因的實時熒光定量PCR方法的報道，該方法可以從臨床樣本中準確、高效地檢測出耐藥基因[11]。隨著多種mcr變體的出現和流行，從不同樣品中篩選耐藥基因mcr-4/5/8也是十分有必要的。本試驗首次構建了針對這3種多黏菌素耐藥基因的多重實時熒光定量PCR檢測方法，不僅可以在培養的細菌中，還可以直接從糞便和土壤樣本中耐藥基因mcr-4/5/8進行篩選。試驗結果表明，本試驗建立的熒光定量檢測方法具有非常高的靈敏度，其中，mcr-4/5/8的檢測限分別為3.4×100～7.9×108、1.4×101～1.0×109、2.9×101～2.4×108拷貝/μL，檢測靈敏度最低可以達到3.4個質?？截悢?。本次試驗未能在環境樣本中檢測出耐藥基因mcr-4/5/8，較難評估mcr-4/5/8在畜禽養殖場中的流行情況，這可能與有限的環境樣本數量有關，也可能與這3種基因在全國范圍內的流行特點有關。但是，通過標準曲線相關數據以及陽性菌株的驗證結果，已經充分證明了本試驗所建立方法具有高度的重復性和特異性。

表3 mcr-1及其各變體Table 3 mcr-1 and its variants

mcr-1是國際上首次發現的由質粒介導的多黏菌素耐藥基因，該基因的出現加速了多黏菌素耐藥性在細菌之間的傳播。多黏菌素是目前治療多重耐藥革蘭陰性菌的最后手段，mcr-1及其變體的出現和廣泛流行給臨床治療感染性疾病造成了嚴重的威脅。本試驗建立了針對耐藥基因mcr-4/5/8的快速檢測方法，能夠更好更快地從臨床和環境樣本中篩選出這3種耐藥基因，為畜牧生產和臨床上控制此類耐藥細菌傳播和相關耐藥性研究提供一定的幫助。

總之，本試驗所構建的實時熒光定量PCR檢測方法，能夠快速、特異、靈敏地檢測出菌液、糞便以及土壤樣本中的mcr-4、mcr-5或mcr-8基因，且該方法適用于任何具有熒光定量PCR儀的實驗室，方便快捷、容易操作，可用于評估人類和動物中該藥物抗性的流行程度[9]。