豬囊尾蚴病患者血清與豬源囊蟲蟲體蛋白Label-free定性蛋白質(zhì)組學(xué)研究

劉書婷，楊立娟,蔡亞南，王 丹，楊小潔，趙 權(quán)，張 媛

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

豬囊尾蚴病(Cysticercoids cellulosae)是由豬帶絳蟲(Taeniasodium)的幼蟲寄生在人或豬等宿主體內(nèi)而引起的一種重要人獸共患寄生蟲病，寄生在各組織器官和橫紋肌，主要是腦和肌肉中。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)可通過電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(Computed tomography,CT)和核磁共振(Magnetic resonance imaging,MRI)對豬囊尾蚴病進(jìn)行診斷，但二者不僅成本較高、鄉(xiāng)村可用性低，而且未成囊的感染前期無法被診斷，最終還需通過獲取節(jié)片或蟲卵確診。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)在豬囊尾蚴病的快速診斷中存在局限性，當(dāng)前需要篩選有效特異性抗原或抗體建立診斷方法。孫樹漢等[1]通過探針篩選出4個 特異性抗原基因，景志忠等[2]首次成功從構(gòu)建的六鉤蚴(Oncosphere)文庫中篩選出TsO1基因，Robles等[3]從豬帶絳蟲噬菌體展示文庫分離的2個可用的候選抗原基因均具有一定的特異性和靈敏度，但與其他類似寄生蟲有較多的交叉反應(yīng)，使特異性檢測方法的建立陷入較大的困難。目前寄生蟲蛋白組學(xué)方法篩選抗原逐漸成熟，可利用新的蛋白組學(xué)方法篩選豬囊尾蚴的特異性蛋白。

蛋白組學(xué)技術(shù)對蛋白質(zhì)的定量與定性有重要意義[4]。蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)包括標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)和無標(biāo)記(Label-free)定量蛋白質(zhì)組學(xué)[5]。Label-free 相對于標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)，具有無需標(biāo)記、耗費(fèi)低、操作簡單、樣本廣泛和檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[6]，逐步應(yīng)用在寄生蟲引起相關(guān)疾病的研究中。Label-free 定量蛋白質(zhì)組學(xué)雖被廣泛應(yīng)用于研究機(jī)體生理功能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)[6]，但在研究豬囊尾蚴方面使用該技術(shù)卻鮮有報(bào)道，因此本試驗(yàn)利用 Label-free 技術(shù)對患者血清和囊蟲蟲體的全蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究。本試驗(yàn)對豬囊尾蚴病患者血清和蟲體的蛋白進(jìn)行胰酶酶解，通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS/MS)對豬囊尾蚴患者血清和蟲體進(jìn)行蛋白組學(xué)研究和分析，以期尋找到患者感染囊蟲病后與囊蟲相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，并闡明寄生機(jī)制和構(gòu)建靈敏度高、特異性強(qiáng)的診斷方法，最終為豬囊尾蚴病的診斷提供新的依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與樣品來源

1.1.1 材料與試劑 BCA試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 患者血清和蟲株來源 患者血清由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院提供，經(jīng)CT或MRT確診的肌肉囊尾蚴病患者和腦囊尾蚴病患者共18例。豬源蟲株由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 蛋白提取和肽段酶解 樣品從-80 ℃取出，4 ℃，12 000 g離心10 min，去除細(xì)胞碎片，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，用Thermo公司生產(chǎn)的試劑盒參照PierceTMTop12 Abundant Protein Depletion Spin Columns Kit說明書去除高豐度蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將提取的蛋白通過胰酶酶解，對酶解后的蛋白進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分級、液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)分析，進(jìn)行后續(xù)操作。

1.2.2 功能預(yù)測 通過基因本體論(GO，http://www.geneontology.org/)[7]、京都基因和基因組百科全書(KEGG，http://www.genome.jp/kegg/)[8-9]和同源基團(tuán)簇(COG，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cog/)[10]3個數(shù)據(jù)庫對蛋白注釋、預(yù)測基因和蛋白質(zhì)的功能。費(fèi)舍爾精確測試，然后進(jìn)行FDR校正[11]，以確定明顯豐富的圍棋條件或路徑。以FDR校正，P<0.05作為明顯富集的閾值。

1.3 倫理批準(zhǔn)和患者知情同意 本研究不涉及倫理批準(zhǔn)，患者知曉并同意血清蛋白分析。

2 結(jié)果

2.1 蛋白鑒定及質(zhì)譜檢測 本試驗(yàn)中，通過質(zhì)譜分析共得到426 795張二級譜圖。質(zhì)譜二級譜圖經(jīng)蛋白理論數(shù)據(jù)搜庫后，得到可利用有效譜圖數(shù)為38 163，譜圖解析共鑒定到13 347條肽段，其中特異性肽段為8 900。其中3次重復(fù)試驗(yàn)一共鑒定到血清中有595個蛋白，囊蟲有63個蛋白，見表1。

表1 質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果基本統(tǒng)計(jì)Table1 Basic statistics of MS results

通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析患者血清和囊蟲蛋白，韋恩圖展示二者各自的生物學(xué)重復(fù)交集，患者血清的蛋白交集為323個，囊蟲的蛋白交集為4個，3次重復(fù)試驗(yàn)滿足生物學(xué)重復(fù)，見圖1。患者血清和囊蟲的交叉蛋白為1個，見圖2。患者血清和囊蟲蛋白的平均分子量大小都集中分布在10～110 kDa。

圖1 蛋白質(zhì)組韋恩圖Fig.1 Wayne diagram of proteomeA：囊蟲組的韋恩圖；B：患者血清組的韋恩圖A:Wayne diagram of Cysticercosis group;B:Wayne diagram of patient serum group

圖2 豬源囊蟲和患者血清交叉蛋白韋恩圖Fig.2 Wayne diagram of cross proteins of porcine Cysticercosis and patients’serumA：囊蟲；B：患者血清;1:A0A0R3X5M7A:Cysticercosis;B:Patient serum1：A0A0R3X5M7

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 GO分析 按照生物過程(Biological process，BP)、細(xì)胞組成(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)三類從不同角度注釋蛋白。GO分析顯示，患者血清蛋白主要參與15種BP，其中478個蛋白參與細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程，474個蛋白參與單一生物體系進(jìn)程，432個蛋白參與生物學(xué)調(diào)節(jié)，其他參與代謝等進(jìn)程；主要具有8種CC，489個蛋白來自細(xì)胞器內(nèi)，484個蛋白分布于細(xì)胞內(nèi)，437個蛋白則在細(xì)胞外區(qū)，其他分布于大分子復(fù)合物等內(nèi)；有8種分子功能，517個蛋白參與結(jié)合功能，217個蛋白參與催化功能，74個蛋白有分子調(diào)節(jié)劑功能，其他蛋白有參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活動等功能。囊蟲蛋白主要參與8種BP,其中20個蛋白參與細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程，16個蛋白參與代謝進(jìn)程，11個蛋白參與單一生物體系進(jìn)程，其他蛋白參與生物學(xué)調(diào)節(jié)等進(jìn)程；其有6種CC，16個蛋白位于細(xì)胞內(nèi)，14蛋白分布在大分子復(fù)合物中，13個蛋白分布在細(xì)胞器中；其具有7種分子功能，25個蛋白具有結(jié)合功能，12個蛋白有催化功能，2個蛋白有轉(zhuǎn)運(yùn)活性，其他蛋白參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活動等。

2.2.2 COG分析 患者血清所有鑒定的蛋白質(zhì)被分為22個COG簇，包括 O(翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶，Posttranslational modification,protein turnover,chaperones)、R(僅限一般功能預(yù)測,General function prediction only)、T(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，Signal transduction mechanisms)，其中“翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶簇”的匹配蛋白在所有COG中所占比例最大；囊蟲所鑒定的蛋白質(zhì)被分為16個COG簇，包括：T、O、K(轉(zhuǎn)錄,Transcription)，其“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制簇”匹配蛋白在所有KOG中所占比例最大。

2.2.3 KEGG分析 通過費(fèi)舍爾檢驗(yàn)法對患者血清進(jìn)行KEGG分析(其只能檢測到患者血清的功能)，并計(jì)算q值，見中插彩版圖3。患者血清蛋白主要富集在補(bǔ)體與凝血級聯(lián)(Complement and coagulation)，ECM受體相互作用(ECM-receptor interaction)，類似金黃色葡萄球菌感染(Staphylococcusaureusinfection)相關(guān)的生物學(xué)通路、同樣涉及免疫相關(guān)的通路：PI3K-Akt信號通路、細(xì)胞黏附分子(Cams)等關(guān)鍵通路。

圖3 鑒定到血清蛋白在KEGG通路中富集分布?xì)馀輬DFig.3 KEGG pathway enrichment bubble plot of identified serum protein

2.2.4 蛋白結(jié)構(gòu)域富集 鑒定到的蛋白結(jié)構(gòu)域通常在25～500個氨基酸長度，基于蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，對所有囊蟲蛋白在Uniprot數(shù)據(jù)庫比對，尋找極為保守的結(jié)構(gòu)域，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種屬中 Histone H2A、H2B、H3的基因和Histone-fold結(jié)構(gòu)域非常保守。對Histone H2A、H2B、H3與Histone-fold結(jié)構(gòu)域進(jìn)行費(fèi)舍爾檢驗(yàn)并FDR校正P值后，計(jì)算q值，繪出氣泡圖，見中插彩版圖4。結(jié)構(gòu)域Histone H2A、H2B、H3以及Histone-fold結(jié)構(gòu)域P值最低，同時是涉及蛋白數(shù)量最多的2個結(jié)構(gòu)域。

圖4 鑒定到囊蟲蛋白在蛋白結(jié)構(gòu)域分類中富集分布?xì)馀輬DFig.4 Protein domain enrichment bubble plot of identfied Cysticercus protein

2.3 豬源囊蟲和豬囊尾蚴病患者血清的交叉蛋白 通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定分析，豬源囊蟲與患者血清有1個交叉蛋白，即A0A0R3X5M7蛋白。通過亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)該蛋白位于細(xì)胞核內(nèi),主要存在于翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶簇中，是SWI/SNF復(fù)合物中依賴性ATP的染色體重塑復(fù)合物。

3 討論

人感染豬囊尾蚴病主要通過免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)對侵入機(jī)體的寄生蟲進(jìn)行防御，囊尾蚴蟲在感染宿主過程中，為適應(yīng)不同宿主的寄生環(huán)境，其向宿主釋放一系列的分泌物來改變自身及周圍條件，必然改變宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)或改變蛋白質(zhì)的相互作用，這些蛋白的改變則能夠反應(yīng)患病的狀態(tài)，逃避宿主的免疫反應(yīng)[12]。蟲體對環(huán)境變化敏感，豬囊尾蚴蟲體中分泌型蛋白與患者血清中分泌型蛋白存在相互作用，通過參與代謝、生物學(xué)調(diào)節(jié)等進(jìn)程，間接調(diào)節(jié)宿主感染寄生蟲的相關(guān)免疫反應(yīng)。

本試驗(yàn)對患者血清和囊蟲樣本全蛋白進(jìn)行Label-free定性分析，通過KEGG的富集分析，發(fā)現(xiàn)囊蟲分泌的蛋白主要影響補(bǔ)體與凝血級聯(lián)反應(yīng)。通過結(jié)構(gòu)域富集預(yù)測，發(fā)現(xiàn)囊蟲與進(jìn)緣物種中的其他絳蟲屬物種高度保守。

補(bǔ)體系統(tǒng)作為宿主一種重要的生物學(xué)作用的效應(yīng)系統(tǒng)和效應(yīng)放大系統(tǒng)，廣泛參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)也可以介導(dǎo)免疫溶菌和溶血作用，同時也是連接固有免疫和獲得性免疫的橋梁[13]。動物患病時其總補(bǔ)體含量或單一補(bǔ)體分子含量可發(fā)生改變，因此對體液中補(bǔ)體水平的測定，對疫病的診斷具有一定意義[13]。豬囊尾蚴患者機(jī)體的補(bǔ)體系統(tǒng)在不同感染狀態(tài)下以不同的途徑被全面的激活，說明在天然防御系統(tǒng)中，特別是在感染的早期，補(bǔ)體系統(tǒng)起著重要的作用。總之，補(bǔ)體凝血系統(tǒng)在豬囊尾蚴感染過程當(dāng)中是一個極其復(fù)雜的過程，本試驗(yàn)僅僅是說明了這一現(xiàn)象，其中涉及的機(jī)理需要進(jìn)一步的探索。

組蛋白的基因非常保守。親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種屬中，4種組蛋白(H2A、H2B、H3、H4)氨基酸序列都非常相似，染色質(zhì)中的組蛋白與DNA的含量之比為1∶1。染色質(zhì)是由許多核小體組成的，H2A、H2B、H3和H4各2個分子構(gòu)成的8聚體是核小體的核心部分，不同生物的H1序列變化較大，H1的作用是與線性DNA結(jié)合以幫助后者形成高級結(jié)構(gòu)。組蛋白是已知蛋白質(zhì)中最保守的。結(jié)構(gòu)域富集預(yù)測結(jié)果驗(yàn)證了囊蟲外分泌蛋白的高度保守性。蛋白A0A0R3X5M7是SWI/SNF復(fù)合物中依賴性ATP的染色體重塑復(fù)合物,在真核生物中高度保守。因此打破囊尾蚴病目前的困境，可以避免與其他類似寄生蟲的交叉反應(yīng)。通過Lable-free方法為篩選特異性診斷標(biāo)識提供便捷[15]。

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)獲取了囊蟲的分泌產(chǎn)物，試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示了豬囊尾蚴病患者感染后，主要與補(bǔ)體和凝血系統(tǒng)有關(guān)。本試驗(yàn)提供了新的角度來認(rèn)識豬囊尾蚴病，從血清中可以檢測到屬于囊蟲分泌的相關(guān)蛋白，表明囊蟲的分泌產(chǎn)物可能對宿主有直接的靶向作用。試驗(yàn)中篩選出的蛋白A0A0R3X5M7為從囊蟲病患者中檢測出的囊蟲外分泌蛋白，可以作為解決豬囊尾蚴病不同感染發(fā)育時期的診斷標(biāo)識蛋白。預(yù)測的囊蟲蛋白保守結(jié)構(gòu)域主要為Histone H2A、H2B、H3和Histone-fold。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究囊尾蚴寄生和特異性抗原診斷標(biāo)識提供參考依據(jù)及思路，為囊尾蚴蟲與宿主之間的相互關(guān)系及演變規(guī)律提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以期為豬囊尾蚴的臨床診斷提供一定的客觀依據(jù)，服務(wù)于我國豬囊尾蚴病的防控。