3種豬病毒多重熒光PCR同步檢測和鑒別方法的建立

史喜菊，賴平安，張 偉，張紅梅，劉全國，柏亞鐸，徐立偉，種 焱

(1.中國海關科學技術研究中心,北京 朝陽 100026;2.北京海關，北京 朝陽 100026)

近些年我國對于活動物的進口需求逐年遞增，每年種豬進口數量都超過2萬頭，供港、澳活豬數量也非常巨大。對于這些出入境的動物每頭都要進行檢疫，目前主要的豬病檢疫對象都是對養殖業危害巨大、世界動物衛生組織(OIE)重點關注、世界各國重點防控的疫病。但目前的檢測標準和方法基本上都是針對某種病原的單一檢測，針對不同的檢疫條款，往往需要逐個檢測不同病原。如果條款中沒有規定檢測某種疾病，但事實上動物可能已經感染了，就會造成漏檢。而且，進境動物經過長途運輸后，在隔離檢疫期間可能會出現一些臨床疾病，很多病原都可以引起相似的臨床癥狀，現有單一檢測技術難以全面、真實地反應畜禽感染狀態和發病死亡原因[1-2]。因此，本研究選擇了臨床上經?；旌细腥居蛛y以鑒別診斷的偽狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)和豬圓環病毒2(Porcine circovirus type 2，PCV-2)[3-6]，建立了可用于這3種病毒混合感染檢測和鑒別診斷的多重熒光PCR方法，以實現多種病原同步檢測、快速靈敏地篩查“未知”病原并對混合感染進行鑒別診斷的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 偽狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)和豬圓環病毒2(PCV-2)，均由本實驗室收集、保存；質控對照品及其他用于特異性測試的病毒對照品，均為本實驗室制備的體外重組質粒。

1.2 試劑 IQ Powermix PCR是BioRad公司產品；病毒總核酸提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；探針、引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 多重熒光PCR反應引物和探針設計 根據PRV、PPV和PCV-2的基因序列特點，通過CLCMain Workbench 7.0.3和BioEditor 1.6.1軟件進行了多重比較，分別選取了最為保守的基因片段gE基因、NS1基因和ORF2基因作為擴增靶基因，根據多重熒光PCR引物、探針設計原則[1,7-8]以及后續標準化反應體系和程序要求，利用Primer 3.0設計了引物和探針，所有引物和探針序列均經過二級結構和二聚體以及錯配和交叉反應性檢驗[1,9-12]，其序列如表1所示。引物和探針用滅菌水稀釋成100 mmol/L儲藏液，-20 ℃保存備用。

表1 PRV、PPV和PCV-2一步法多重熒光PCR檢測引物和探針Table 1 Primers and probes of one-step multiplex real-time PCR for PRV,PPV and PCV-2

1.3.2 陽性質控品的制備 按照常規方法[1,13]，分別擴增PRV的gE基因片段(2 745 bp)、PPV的NS1基因片段(500 bp)和PCV-2的ORF2基因片段(666 bp)，并克隆于pGEM-Teasy載體，經PCR和酶切鑒定，分別獲得陽性重組質粒PRV-gE-DNA、PPV-NS1-DNA和PCV2-ORF2-DNA，經測序確認后測定其OD260值和OD280值，按照質?？截悢?copies/μL)=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/質粒大小(bp)×660計算質粒濃度，保存于-20 ℃備用。

1.3.3 多重熒光PCR反應體系的建立 將引物和探針儲備液進行10倍梯度稀釋，將引物進行充分混合，配制成引物混合物終濃度為400 nmol/L，探針終濃度為200 nmol/L，反應混合液包括2×IQ Powermix PCR緩沖液10 μL、引物混合物0.8 μL、PRV探針0.4 μL、PPV探針0.2 μL、PCV-2探針0.2 μL，模板DNA 1～5 μL，DEPC處理水補齊至總反應體積20 μL。將混合液充分混合后，最后加入模板，按照95 ℃、5 min；95 ℃、15 s，60 ℃、45 s，44個循環的反應程序進行一步法熒光PCR反應，所用設備為BioRad公司的CFX-96。

1.3.4 標準曲線繪制和最低檢測限確定 分別將PRV、PPV和PCV-2質控品進行10倍梯度稀釋后進行熒光PCR，用模板濃度-熒光Ct值做濃度標準曲線，最高稀釋倍數能檢測出的Ct值所對應的濃度即為最低檢測限。

再將PRV、PPV和PCV-2質控品等量混合后，進行10倍梯度稀釋，進行多重熒光PCR，用模板濃度-熒光Ct值做濃度標準曲線，最高稀釋倍數能檢測出的Ct值所對應的濃度即為最低檢測限。

1.3.5 特異性試驗 選擇了實驗室制備的豬流感病毒(SIV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2型(PCV-2)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬細小病毒(PPV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)共9種豬病毒質控品，分別用PRV、PPV和PCV-2的引物和探針進行了單一熒光PCR，驗證引物和探針的特異性。

用建立的多重熒光PCR對上述9種病毒質控品進行了檢測，驗證引物和探針混合后多重反應體系的特異性。

1.3.6 多重熒光PCR和單一熒光PCR的比較 將PRV、PPV和PCV-2質控品等量混合后進行10倍梯度稀釋，分別進行多重熒光PCR和PRV、PPV和PCV-2單一熒光PCR，將相同模板濃度對應的熒光Ct值進行比較，求解回歸方程，比較多重熒光PCR和各單一熒光PCR的符合性。

1.3.7 臨床樣品測試 對實驗室收集的已知PRV陽性組織樣品31份、PPV陽性組織樣品52份、PCV-2陽性組織樣品49份以及陰性樣品122份，用病毒基因組總核酸提取試劑盒(TIANamp Virus DNA/RNA Kit)按照說明書要求提取總核酸，用建立的多重熒光PCR進行檢測，進行臨床樣品驗證。

2 結果

2.1 陽性質控品的定量 將制備好的陽性質控品，分別用紫外分光儀測定其260 nm和280 nm的吸光度值并計算出質?？截悢?，結果見表2。

表2 陽性質控品DNA純度及含量測定Table 2 DNA purity and quantity of positive control plasmids

2.2 標準曲線繪制和最低檢測限確定 分別用PRV、PPV和PCV-2質控品做濃度-Ct值標準曲線(圖1)。從圖1可以看出，標準曲線PCR擴增效率E值、R2和曲線斜率均在正常范圍內，說明擴增效率良好。將模板進行1011倍稀釋仍能檢測到熒光信號，根據表2計算出對應的最低檢測限在3.51～8.99 拷貝/μL。

圖1 單一熒光PCR標準曲線Fig.1 Standard curves of single real-time PCRA:PRV；B:PPV；C:PCV-2

PRV、PPV和PCV-2混合質控品做多重熒光PCR濃度-Ct值標準曲線，如封二彩版圖2。從中可以看出，各個多重熒光參數E值、R2和曲線斜率均在正常范圍內，說明擴增效率并沒有多重混合受到干擾。最高稀釋倍數檢出限跟單一熒光PCR沒有明顯差異，均可達到10拷貝/μL以下。

圖2 PRV、PPV和PCV-2多重熒光PCR標準曲線Fig.2 Standard curve of multiplex real-time PCR of PRV,PPV and PCV-2

2.3 特異性檢測 結果表明，每種病毒的引物和探針均只能擴增出各自的病毒核酸，其他病毒模板的擴增均為陰性，表明所設計的引物和探針特異性良好。利用建立的多重熒光PCR方法對1.3.5中的病毒進行檢測，結果PRV、PPV和PCV-2有擴增曲線，其他病毒均無特異性擴增信號，表明所建立的方法特異性良好，結果見表3。

2.4 多重熒光PCR和單一熒光PCR的比較 利用相同模板對多重熒光PCR和單一熒光PCR的符合性測試結果表明，PRV、PPV和PCV-2單一熒光PCR與多重熒光PCR的相關性系數R2分別為0.999 9、0.998 7和0.998 4，說明多重熒光PCR和各單一熒光PCR的符合性良好，多重熒光PCR并沒有產生相互干擾，擴增效率沒受影響，結果見封二彩版圖3。

圖3 多重熒光PCR與各單一熒光PCR的比較Fig.3 Comparasion between multiplex real-time PCR and the singular real-time PCRsA：多重熒光PCR與PRV單一熒光PCR的比較；B：多重熒光PCR與PPV單一熒光PCR的比較；C：多重熒光PCR與PCV-2單一熒光PCR的比較A:Comparasion between multiplex real-time PCR and PRV singular real-time PCR；B:Comparasion between multiplex real-time PCR and PPV singular real-time PCR；C:Comparasion between multiplex real-time PCR and PCV-2 singular real-time PCR

2.5 臨床樣品測試 用本研究建立的多重熒光PCR對已知的31份PRV陽性樣品、52份PPV陽性樣品和49份PCV-2陽性樣品及122份陰性樣品進行檢測，其結果均與樣品已知狀態一致。不同的是，由于這些已知樣品原來只做了單目標病原檢測，其他病毒感染情況未知，但是通過本研究建立的多重熒光PCR檢測，發現在共計132份陽性樣品中，有15份呈PRV和PPV雙陽性(15/132)，有29份呈PPV和PCV-2雙陽性(29/132)，有14份呈PRV和PCV-2雙陽性(14/132)，有9份呈PRV、PPV和PCV-2三重陽性(9/132)，表明PRV、PPV和PCV-2混合感染現象比較多見，多重熒光PCR可以檢測到原來靠單一熒光PCR沒有進行篩查的非目標病原，檢出了混合感染，避免了漏檢。

3 討論

PRV、PPV和PCV-2均為DNA病毒，是引起豬多系統疾病的常見病原，經?；旌细腥?，診斷和防治比較困難，是世界各國養豬場檢疫凈化的主要對象[1-5]。本研究針對目前單一病原檢測方法的不足，建立了PRV、PPV和PCV-2三種豬病毒一步法多重熒光PCR檢測和鑒別方法。

方法敏感性分析表明，本研究建立的多重熒光PCR方法最低檢測限可以達到10拷貝/μL以下，與各自病原單一熒光PCR相比，雖然略有降低，但沒有明顯差異，這與報道的熒光PCR技術的敏感性指標一致[1,7,10]。

方法特異性分析表明，本研究建立的多重熒光PCR引物和探針特異性均為100%，3個病原的引物和探針混合后，特異性并沒有受到干擾。特別是PCV-2病毒變異比較大，為了最大限度地覆蓋所有分離毒株，設計了3條反向引物和2條探針，這些引物在后期單一和多重擴增中各項PCR參數均在正常范圍內，擴增效率良好。

多重熒光PCR與單一熒光PCR比較分析表明，對于同一濃度模板，多重熒光PCR分別與各自單一熒光PCR擴增得到的Ct值相關性非常高，R2可達0.999，再次證明了引物和探針的混合并沒有互相干擾，沒有影響擴增效率。據報道，三重熒光PCR可以達到與單一熒光PCR相等的指標參數，但是四重以后敏感性和特異性均會受到不同程度的影響[7,10-11],本研究也曾嘗試加入第4種病原，四重熒光PCR標準曲線指標參數很難都落在合理范圍內(未公開發表)，說明產生了干擾。

本研究建立的多重熒光PCR對已知陰陽性樣品檢測結果與已知完全一致。不同的是，從這132份 陽性樣品中檢測到PRV和PPV混合感染15份(15/132)，檢測到PRV和PCV-2混合感染14份(13/132)，PPV和PCV-2混合感染29份(29/132)，檢測到這3種病原混合感染9份(9/132)。出現差異的原因是這些樣品之前是單項病原檢測篩選出來的，并沒有對其他項目進行檢測，而用多重熒光PCR檢測后，發現了已經存在的二重和三重感染，表明這3種病原在臨床上混合感染比較常見，這在Cao等(2005年)和Lee等(2007年)的研究中也有過類似報道[3-4]。這正是建立此多重檢測方法的目的，實現一次采樣、一次分析，多種病原同步檢測，可以對混合感染的“未知病原”進行同步篩查和鑒別。