不同發育期牦牛肺組織中血管形成相關基因的表達譜

孟祥瓊，周 娟，陳一博，成若通，俞紅賢，3，魏 青，3

(1.青海大學生態環境工程學院，青海 西寧 810016；2.青海大學農牧學院動物醫學系，青海 西寧 810016；3.省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海 西寧 810016)

牦牛(Bosgrunniens)是以青藏高原為起源地的特有物種，其對高原環境有良好適應性[1]，早已引起國內外學者的廣泛關注，并開展了包括組織形態結構、血氧運輸、細胞呼吸代謝以及牦牛適應低氧的分子機制等多方面研究。在發育學方面，研究表明高原牦牛的肺部組織發育比低海拔黃牛快，且高海拔牦牛1日齡時肺泡隔內的毛細血管較為豐富，毛細血管網較黃牛致密，分布也較為廣泛，這便于高原牦牛快速適應低氧環境[2-3]。為進一步研究牦牛肺組織發育的分子機制及其與牦牛適應低氧的關系，本試驗選取1日齡、30日齡、180日齡和成年牦牛的肺組織為研究對象，通過對其轉錄組學數據分析，篩選與血管形成相關的基因，并結合其生長發育特點，闡明這些基因的變化規律對牦牛出生后肺組織內血管生長發育的影響，為進一步揭示牦牛低氧適應機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 本試驗以青海省海晏縣(海拔3 200 m)環湖型牦牛為研究對象，分別取1日齡(HY-1)、30日齡(HY-30)、180日齡(HY-180)及成年牦牛(HY-A)4個發育階段的肺組織，其中HY-1和HY-A組牦牛各2頭，HY-30和HY-180組牦牛各3頭。

1.2 試驗試劑 TRIzol裂解液、dNTP Mixture、10×PCR Buffer(Mg2+plus)，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；TianScript cDNA、TB Green?PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)、TaKaRaExTaq等，均購自TaKaRa生物工程(大連)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 牦牛肺組織總RNA的提取及cDNA第1條鏈的合成 分別取1日齡、30日齡、180日齡和成年牦牛的肺組織，用TRIzol法分別提取4個年齡段的總RNA，用核酸蛋白檢測儀測定濃度后，按照反轉錄試劑盒說明書步驟反轉錄成cDNA的第1條鏈，-20 ℃保存。

1.3.2 引物設計合成 在美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)上查詢相關基因的序列，用Primer 6.0軟件設計特異性引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 qRT-PCR特異性引物序列Table 1 The information of primers for qRT-PCR amplification

1.3.3 qRT-PCR 以β-Actin為內參，目的基因和內參基因分別設置3個平行。采用相對ΔΔCt法(2-ΔΔCt)對qRT-PCR試驗數據進行分析。

1.3.4 轉錄組數據分析 轉錄組數據進行初步分析，以倍數差異(|FoldChange|)>1.5，錯誤發現率(FDR)≤0.05為條件篩選出差異表達基因，統計每個發育階段的血管生成相關基因，然后對血管生成相關基因在各個時期表達量的變化趨勢進行分析。

2 結果

2.1 轉錄組數據驗證 以每個發育階段牦牛肺組織的cDNA為模板進行qRT-PCR試驗，結果如中插彩版圖1所示，mRNA水平表達量與轉錄組數據目的基因的表達水平相似，變化趨勢與轉錄組數據基本一致。

圖1 目的基因在每個發育階段的相對表達量Fig.1 Relative expression of the target gene at each developmental stage

2.2 差異表達基因篩選 通過差異分析軟件DESeq2對2個不同發育階段間的差異表達基因進行分析，檢驗參數為|FC|>1.5，padj<0.05，FDR<0.05。檢驗結果如中插彩版圖2所示，1日齡和30日齡組別比較，共表達基因17 218個(69.71%)，差異基因311個(1.26%)，其中上調基因139個(0.56%)，下調基因172個(0.70%)；30日齡和180日齡組別比較，共表達基因17 404個(70.47%)，差異基因3 190個(12.93%)，其中上調基因1 775個(7.19%)，下調基因1 415個(5.74%)；180日齡和成年牦牛組別比較，共表達基因17 232個(69.77%)，差異基因693個(2.81%)，其中上調基因430個(1.74%)，下調基因263個(1.06%)。

圖2 差異表達基因維恩圖Fig.2 Venn diagram of differentially expressed genesA：共同差異表達的基因；B：共同上調表達的基因；C：共同下調表達的基因A:Common differentially expressed genes;B:Common up-regulated genes;C:Common down-regulated genes

綜上所述，30日齡組和180日齡組比較差異表達基因數最多。且3個比較組中的共同差異基因為18個(表2)，其中均為上升的基因有5個，分別是MIA、SEMA3C、NTN4、ADGRE1和DMXL2，沒有共同下調的差異表達基因。

表2 比較組別中共同的差異表達基因Table 2 Differentially expressed genes in the comparison groups

2.3 血管生成相關基因篩選 結合相關文獻共篩選出血管形成相關基因39個(表3)。

表3 血管形成相關基因注釋Table 3 The annotation of angiogenesis-related genes

2.4 血管生成相關基因各時期表達量變化趨勢 39個血管生成相關基因可分為3類，包括血管組成、抑制血管生成和促進血管生成。利用轉錄組數據分析各發育階段基因表達量的變化趨勢(中插彩版圖3)。血管組成類基因共4個，表達量均在30日齡 時達到最大，之后便急劇降低，并且30日齡之前的表達量均大于180日齡和成年的表達量，這表明牦牛在30日齡之前主要進行物質積累，并為后期的生長發育做準備(中插彩版圖3A)。抑制血管生成的基因共6個，表達量均在180日齡時大幅降低，之后的發育階段也持續下降(中插彩版圖3B)。促進血管生成的基因共29個，大部分基因在180日齡時表達量達到了最大，隨后便逐漸降低，少數基因表達量在30日齡時達到最高后逐漸降低(中插彩版圖3C)。

圖3 血管生成相關基因表達量變化趨勢Fig.3 Trends in the expression of angiogenesis-related genesA：血管組成類基因；B：抑制血管生成的基因；C：促進血管生成的基因A:Angiogenesis-like genes;B:Angiogenesis-inhibiting genes;C:Angiogenesis-promoting genes

3 討論

研究人類肺組織發育發現，肺血管形成是肺泡發育的重要特征，持續的肺血管網生成可有效促進氣血交換[4]。肺組織損傷造成缺氧，將導致肺泡發育受阻，進而使得肺微血管形成減少[5-6]。有研究發現，出生后持續高氧作用將有利于大鼠肺內微血管形成[7]。而前期研究發現，牦牛在高原低氧環境下牦牛肺組織發育正常，肺內微血管形成未受影響[8]。動物肺組織內血管的形成也是一個多因子、多通路共同作用的結果[9]。

血管組成類基因(FN1、LAMC1、COL3A1、COL4A1)包括纖連蛋白、層粘連蛋白、III型膠原蛋白和IV型膠原蛋白，其中纖連蛋白能夠與其他多種分子相互作用，參與遷移、生長、凋亡和分化等細胞活動，在發育和生理過程中發揮重要作用，III型膠原蛋白是中空器官(如血管、子宮和腸道)的主要結構成分，IV型膠原蛋白是基底膜的主要結構成分。這4個基因表達量均在30日齡時達到最大，之后便急劇降低，并且30日齡之前的表達量均高于180日齡和成年階段的表達量，這表明牦牛在30日齡之前主要進行物質積累為后期的生長發育做準備。

血管生成是促血管形成因子和抑制因子協調作用的復雜過程，抑制血管生成的基因主要是通過抑制細胞粘附、細胞因子的作用和血管平滑肌的生長進而抑制血管的生成[10]，其基因表達量均在180日齡時大幅降低，之后也基本上都持續下降。促進血管生成的基因主要是通過促進內皮細胞的增殖和遷移，促進細胞粘附和維持血管穩定來促進血管的生成[11]，部分基因在180日齡時表達量達到了最大，其余基因表達量則在30日齡時達到最大。

各年齡比較組共有5個上調表達的基因，有研究報道，FN1在小鼠及其他脊椎動物胚胎的原腸期就已表達[12-13]，除此之外，其在血管細胞的遷移位點的表達量也很豐富[14]，且在小鼠試驗中，纖連蛋白基因的缺失會導致小鼠的血管等發育異常及死亡[15-16]；NTN4也與血管形成密切相關，試驗表明NTN4在體外可以誘導血管內皮細胞的增殖、遷徙并促進新生血管生成[17]，但FN1、NTN4在牦牛體內血管發育的相關研究均未見報道。為研究MIA在爪蟾不同發育階段的表達，對受精卵期(s1)、卵裂期(s4)、原腸胚期(s11)、神經胚期(s13、s18)、尾芽期(s28、s32)的胚胎中MIA的表達量進行檢測，結果顯示：從受精卵開始，MIA的mRNA表達即可檢測，并持續表達于胚胎發育各階段[18]，這與本試驗結果是一致的，在牦牛出生后肺組織的發育過程，血管形成貫徹始終。在視網膜形成過程的相關研究中發現，SEMA3C與視網膜內血管形成有關，對基因敲除處理試驗鼠和對照組中基因表達量進行檢測，試驗組小鼠SEMA3C的表達量明顯降低，SEMA3C對視網膜血管生成有調節作用，其缺失會導致形成的血管不穩定，此外，通過組織學染色觀察到新生血管簇有異常生長和視網膜血管滲漏的情況[19-20]，但大型哺乳動物相關研究并未見報道，這是牦牛相關研究的首次報道。

根據前期組織學研究推測，1～30日齡為物質快速積累時期，30～180日齡為血管快速發育時期[21]。而根據上述分析30日齡和180日齡都有升高比較明顯的血管形成的基因，且差異基因表達數量顯著增加(中插彩版圖2)。可見1～30日齡，再到180日齡這個階段血管生成比較劇烈，其中有些促進血管生成的基因表達量并未在180日齡時達到最高，反而在發育早期達到最高，這些基因可能參與早期的血管生成。