2017—2019年四川部分地區PRRSV ORF5基因的遺傳演化分析

唐偉明，秦立廷，董友富，陳 婷，羅 剛，卞 婷，張振東

(1.江蘇科技大學生物技術學院，江蘇 鎮江 212018；2.山東新希望六和集團有限公司，山東 青島 266000；3.青島嘉智生物技術有限公司，山東 青島 266000)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，臨床危害主要表現為母豬繁殖障礙、生長豬呼吸道疾病以及感染豬的繼發感染。自20世紀80年代末和90年代初發現PRRSV以來，到目前為止在全球范圍內仍未取得實質性的控制，給生豬產業帶來了巨大的經濟損失[1]。

PRRSV是一種呈球形、有囊膜的單股正鏈RNA病毒，全長基因組約15 kb，根據國際病毒學分類委員會(International Committee on Taxonomy of Virus,ICTV)最新的分類，其被歸為套式病毒目(Nidovirales)、動脈炎病毒科(Arterividae)中的β動脈炎病毒屬(Betarterivirus)，包括PRRSV1和PRRSV2兩個基因型，代表毒株分別為LV和VR-2332[2]。PRRSV具有廣泛的變異和毒株多樣性，Stadejek等將PRRSV1分為4個亞型[3]，Shi等利用ORF5基因進行的遺傳演化分析，將PRRSV2劃分為9個譜系(Lineage)[4]。目前，我國PRRSV的流行以PRRSV2為主，主要包括4個譜系(Lineage 1,3,5,8)[5-6]。早期流行毒株以CH-1a 為代表的Lineage 8和以BJ-4為代表的Lineage 5為主[7]；2006年，我國出現以JXA1和HuN4等為代表的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，屬于Lineage 8[8]；2010年，我國東南部地區出現以QYYZ為代表的Lineage 3毒株[9]；2013年，NADC30-like毒株(Lineage 1)傳入我國，造成PRRS疫情的新流行[10]；近年來，我國PRRSV毒株流行情況愈加復雜，疫苗演化毒株、多譜系重組毒株、新毒株層出不窮[11-12]，給我國PRRS的防控帶來了巨大的挑戰。

本試驗對2017—2019年四川部分地區PRRSV陽性樣品進行RNA提取，RT-PCR擴增ORF5基因，選取陽性產物進行克隆測序，與PRRSV參考毒株進行比較，以期闡述四川地區PRRSV的流行情況及病毒演化趨勢，為PRRS的防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 PRRSV陽性樣品 47份PRRSV陽性樣品于2017—2019年采集自四川省部分規模化豬場，由山東新希望六和集團有限公司于-80 ℃保存。

1.2 主要試劑 MagZol Reagent，購自Magen生物科技有限公司；2×TaqMaster Mix(Dye Plus)和HiScript II 1 st Strand cDNA Synthesis Kit，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收試劑盒，購自江蘇康為世紀生物科技有限公司；pMD19-T載體，購自TaKaRa公司；DH5α感受態細胞由本實驗室自制。

1.3 RNA提取與反轉錄 將PRRSV陽性樣品研磨、離心，吸取上清300 μL于1.5 mL離心管，加入750 μL MagZol Reagent，徹底裂解后加入200 μL三氯甲烷，室溫靜置5 min，4 ℃離心機中以12 000 r/min離心15 min以形成三相分層體系；小心吸取上層水相轉至新的1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃離心機中以12 000 r/min離心15 min以沉淀RNA；棄掉上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，反復2次；最后吸棄殘留的液體，干燥晾干，加入20～30 μL DEPC水溶解RNA。將提取的RNA按照HiScript Ⅱ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行反轉錄，合成cDNA，置于-20 ℃保存備用。

1.4 引物設計與ORF5基因的擴增 根據GenBank中PRRSV 2的常見參考毒株序列，設計1對可擴增ORF5基因全長序列的引物。引物序列：上游引物ORF5-F：5′-GAGACCATGAGGTGGGCAAC-3′；下游引物ORF5-R：5′-CACTGGCGTGTAGGTAATG-3′，預期擴增片段大小為742 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增反應體系50 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模板5 μL，2×TaqMaster Mix 25 μL，ddH2O 18 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸7 min。

1.5ORF5基因片段的克隆與測序 對ORF5基因RT-PCR擴增產物進行膠回收，克隆于pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，培養16～24 h后，挑取單菌落進行培養，鑒定陽性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

1.6ORF5基因的同源性比對及其遺傳演化分析 使用DNASTAR軟件中MegAligen將獲得的ORF5基因序列與常見參考毒株的ORF5基因序列進行核苷酸同源性分析和氨基酸序列比對；使用MEGA 7軟件將35個ORF5序列與21個參考毒株進行進化樹繪制分析，所用方法為“Maximun Likeihood”，模型為“Kimura 2-parameter substitution”，使用1 000 Bootstrap replicates，PRRSV參考毒株信息見表1。

表1 參考毒株信息Table 1 Reference strains used in the study

2 結果

2.1 PRRSVORF5基因的RT-PCR擴增 對2017—2019年收集的四川省部分規模化豬場的47份 PRRSV陽性病料抽提RNA，利用設計好的引物進行ORF5基因的擴增，結果顯示，47份陽性病料均能擴增出大小為742 bp的目的條帶，部分樣品的電泳結果見圖1。

圖1 PRRSV ORF 5 基因擴增Fig.1 Amplification of PRRSV ORF 5M：DL-2 000 DNA marker；-：陰性對照；1～6：部分樣品M：DL-2 000 DNA marker;-:Negative control;1-6:Several samples

2.2 PRRSVORF5核苷酸同源性分析 47個PCR產物經克隆后測序，共獲得47條PRRSVORF5基因序列，各序列之間的核苷酸同源性為84.2%～100.0%，剔除部分同源性為100%的序列，將35份陽性樣品的核苷酸序列與國內外已發表的參考毒株ORF5基因序列進行同源性比對分析。結果顯示，與PRRSV原始毒株LV(歐洲型)和VR-2332(美洲型)的核苷酸同源性分別為60.7%～64.6%和84.9%～99.3%，表明分離毒株均為PRRSV2。進一步分析，分離毒株與以NADC30等為代表的譜系1毒株核苷酸同源性為86.1%～93.7%，與以QYYZ為代表的譜系3毒株核苷酸同源性為82.6%～84.4%，以HP-PRRSV及其疫苗毒株為代表的譜系8毒株核苷酸同源性為84.2%～99.2%(表2)。其中，分離于不同時間和地區的SC1704與SC1706，SC1807與SC1808，SC1712、SC1713與SC1904核苷酸同源性為100.0%，表明PRRSV可持續傳播與流行。

表2 本試驗測序毒株與參考毒株之間ORF 5核苷酸及推導氨基酸同源性比較Table 2 Homology comparison of ORF 5 nucleotide and deduced amino acid between sequenced strains and reference strains (%)

2.3 PRRSVORF5基因的遺傳演化分析 將35個毒株序列與常見參考毒株的ORF5基因進行比對并構建分子遺傳進化樹(圖2)。結果顯示，35個分離毒株分屬于3個譜系(1,5,8)，其中以VR-2332為代表的譜系5毒株13株(37.1%)，以HP-PRRSV為代表的譜系8毒株10株(28.6%)，以NADC30為代表的譜系1毒株12株(34.3%)，表明四川地區PRRSV的流行主要以該3個譜系毒株為主。

2.4 PRRSVORF5推導的氨基酸同源性分析 將35個毒株ORF5基因推導的氨基酸序列與常見參考毒株進行比對，結果如表2所示，與譜系1毒株NADC30、譜系3毒株QYYZ、譜系5毒株VR-2332和譜系8毒株HP-PRRSV氨基酸同源性分別為83.6%～91.5%、77.6%～83.1%、81.6%～98.5%和82.6%～99.0%。進一步比較發現，SC1702等11個分離毒株ORF5基因在第34位存在1個氨基酸的缺失(圖3)，更有意思的是這11個缺失毒株均屬于譜系1毒株(圖2)，表明該缺失可能存在毒株特異性，值得進一步研究。

圖2 PRRSV ORF 5 基因遺傳進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on PRRSV ORF 5 gene▲：參考毒株；○：分離毒株▲:Reference strains;○:Isolated strains

圖3 PRRSV ORF 5基因推導的氨基酸序列分析(0～100)Fig.3 Sequence analysis of deduced PRRSV ORF 5 amino acid(0-100)▄：氨基酸缺失位點▄:Deletion site of amino acid

3 討論

PRRSV具有極易變異和快速演化的能力，變異株、新毒株層出不窮，據Han等研究分析報道[6]，自2006年HP-PRRSV暴發以來，我國的PRRS疫情可分為3個流行階段，第1階段為2006—2008年，以最初暴發的具有高同源性的HP-PRRSV為主；第2階段為2009—2012年，PRRSV毒株之間的重組活動導致了疫情的再度流行，并且自該時期開始，PRRSV變異與演化的速率呈現出明顯加快的趨勢[13]，這可能與HP-PRRSV減毒活疫苗的逐步推廣使用有關；2013年以來為第3階段，近年來HP-PRRSV似乎“銷聲匿跡”，分離到的毒株多數是HP-PRRSV疫苗毒、疫苗演化毒株及其與NADC30-like毒株的重組毒株。另外，以QYYZ為代表的譜系3毒株也在小范圍內流行。2017年下半年，以nsp2編碼區100個氨基酸的連續缺失為特征的NADC34-like毒株在我國被分離[14]，我國PRRSV臨床毒株的遺傳多樣性和復雜性再次增加。

本試驗通過對2017—2019年四川地區收集的47份PRRSV陽性樣品進行ORF5基因的擴增、克隆、測序，結果發現，近幾年四川地區PRRSV的流行主要以PRRSV 2 譜系1，5，8毒株為主，其中以VR-2332為代表的譜系5毒株占比最高(37.1%)，推測可能與譜系5來源疫苗毒的廣泛使用有關。NADC30-like毒株占比34.3%，超過HP-PRRSV毒株(28.6%)，進一步說明NADC30-like毒株正逐步取代HP-PRRSV，成為該地區的優勢流行毒株，但需要指出的是NADC30-like毒株與HP-PRRSV及其疫苗演化毒株之間的重組毒株越來越多，且ORF5為重組熱點區域，不排除本試驗中的分離毒株是以HP-PRRSV為骨架，ORF5區域為NADC30-like的重組毒株，因此，基于目前國內PRRSV的流行情況，以ORF5進行譜系劃分的標準需進一步商榷。此外，本試驗中未檢測到以QYYZ為代表的譜系3毒株，但其在我國南部部分地區有流行之勢，部分研究已在四川地區檢測并分離到QYYZ-like及其與其他譜系的重組毒株[15]，因此，對譜系3毒株的監測需引起重視。ORF5基因編碼的GP5蛋白是PRRSV重要的囊膜糖蛋白，其第27～41位氨基酸為重要的抗原相關區域，本試驗中發現11個分離株在第34位存在1個氨基酸的缺失，該缺失是否影響GP5蛋白的抗原表達需要進一步研究。更有意思的是，11個缺失毒株均屬于以NADC30-like為代表的譜系1毒株，表明該缺失可能存在毒株特異性，該缺失對PRRSV致病力的影響值得進一步研究。