H9N2病毒感染影響小鼠腸道維生素D受體和鈣離子通道蛋白mRNA的表達

連朋敬，吳韋灑，白江松，白 玉，牛小飛，李靜云，張子卉，喬 健

(中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193)

腸道內鈣離子的主動吸收主要由瞬時受體電位通道蛋白6(Transient receptor potential channel type 6，TRPV6)完成[1]。TRPV6屬于瞬時感受器電位蛋白超家族，是Ca2+選擇性的離子通道，參與維持體內鈣穩態。鈣離子在小腸上皮細胞刷狀緣通過TRPV6的介導進入細胞，再由鈣結合蛋白(Calcium binding protein，CaBP)由細胞刷狀緣頂膜轉移到基底膜，完成鈣離子的吸收[2]。TRPV6在小腸上皮細胞內的表達受維生素D調節。維生素D通過結合細胞內的維生素D受體(Vitamin D receptor，VDR)，調節TRPV6基因的轉錄[3]。因此，VDR和TRPV6與腸道內鈣離子的吸收密切相關。鈣的缺失除了會導致骨質疏松外，還和高血壓、心臟病、糖尿病和癌癥等多種疾病的發生發展有關，特別是老年人，消化吸收能力弱，鈣的吸收率下降，而老年人正是季節性流感的易感人群。然而，流感感染是否會影響到腸道對鈣的吸收仍未可知。H9N2禽流感病毒是目前我國乃至世界范圍內流行最廣的流感病毒之一，不僅可以在家禽中穩定傳播，還可以感染哺乳動物和人[4-6]。H9N2病毒主要侵犯呼吸系統，也可以造成腸道黏膜損傷[7]。本試驗以滴鼻方法用H9N2病毒感染BALB/c小鼠，通過檢測小鼠小腸組織中VDR和TRPV6 mRNA表達變化，初步探討H9N2病毒感染和鈣離子代謝之間可能存在的關系，為以后的相關研究提供一些思路和參考。

1 材料與方法

1.1 H9N2病毒 本試驗所用的H9N2病毒是2008年本實驗室從河北一組患病雞群中分離獲得。經過血凝血抑試驗的鑒定，確定為H9N2亞型禽流感病毒，將其命名為 A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)(GenBank 登錄號為 FJ499463-FJ499470)。經實驗室研究表明，該病毒為低致病性的禽流感病毒[8]。雞胚繁毒后測定病毒毒力，當感染劑量為1×106TCID50時小鼠出現典型臨床癥狀，并且在此接種量下死亡率較低，便于觀察小鼠從感染發病到逐漸恢復的完整過程。

1.2 實驗動物 60只5～6周齡、體重(20±2)g、雄性SPF級 BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.3 動物感染及樣本采集 BALB/c小鼠隨機分組：H9N2感染試驗組和無菌雞胚尿囊液對照組各30只。將H9N2病毒雞胚尿囊液用無菌生理鹽水稀釋到1×106TCID50，無菌尿囊液同等倍數稀釋。小鼠異氟烷吸入麻醉后，試驗組和對照組分別滴鼻接種稀釋后的H9N2病毒雞胚尿囊液和無菌尿囊液，100 μL/只。每天在固定時間點觀察小鼠臨床癥狀，包括體溫、體重及采食量、精神狀態和死亡情況。在H9N2病毒感染后的第3、7、14、21天和第28天 兩組各隨機取5只小鼠，稱重，麻醉后脫頸處死，采集肺臟并稱重。采集十二指腸，用無菌PBS清洗凈十二指腸后，迅速將組織凍存于液氮中。

1.4 絕對熒光定量PCR檢測 將組織在液氮中研磨成粉末狀，于TRIzol裂解液中裂解。用組織樣本基因組提取試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW2094)，按照試劑盒說明書從組織樣本中提取總RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外吸收法測定RNA的質量。使用Primer 3.0軟件設計引物，引物序列見表1，引物由Invitrogen公司合成。使用Thermo Script RT-PCR試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，反應完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結果，目的片段進行瓊脂糖凝膠回收。回收的PCR產物進行TA連接，轉化感受態細胞DH5α，并進行菌落PCR陽性克隆鑒定，無誤后，提取質粒進行測序鑒定，發現無任何突變，與目的基因序列一致，可作為絕對定量的標準品。用紫外分光光度計測定質粒OD260值，運用公式得到相應拷貝數。換算公式為質粒拷貝數(copies/μL)=質粒濃度(ng/μL)×6.02×1023/(質粒分子量×660)。將質粒標準品進行10倍梯度稀釋，每個梯度取2 μL做模板建立標準曲線，并得出標準方程。將所有DNA樣品進行Realtime PCR檢測，每個樣本做3個重復。VDR按以下程序進行：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s，40個PCR循環。TRPV6按以下程序進行：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40個PCR循環。之后進行熔解曲線步驟。

表1 PCR引物Table 1 PCR primer

1.5 統計學分析 以Ct值為縱坐標，基因拷貝數為橫坐標，用質粒標準品構建標準曲線。將樣本DNA檢測Ct值代入標準曲線方程得出樣本DNA拷貝數。試驗數據均使用SPSS 19.0軟件處理，并分析組間差異(當P<0.05時，表示其在統計學意義上有顯著性差異)。再使用GraphPad Prism 7進行圖表繪制。所有試驗數據都用平均值±標準誤表示。

2 結果

2.1 構建VDR和TRPV6基因標準曲線 以VDR和TRPV6的特異性的引物分別進行PCR反應后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現特異性條帶位于103 bp和163 bp處，且產物單一，與預期大小一致，說明引物特異性強，可進行下一步試驗(圖1)。菌落PCR電泳鑒定結果條帶分別處于103 bp和163 bp，與預期的2個目的片段的大小一致，說明電泳檢測得到了目的片段，為陽性克隆(圖2)。

圖1 VDR(A)和TRPV6(B)基因PCR擴增結果Fig.1 The result of VDR(A)and TRPV6(B)gene amplification by PCR1:DNA相對分子質量標準；2～3:目的基因片段；4：陰性對照1:DNA marker;2-3:Target gene segment;4:Negative control

圖2 陽性克隆菌落的PCR鑒定Fig.2 Identification of positive clone colony by PCR1:DNA 相對分子質量標準；2：VDR 目的片段；3～5：陰性對照；6：TRPV6目的片段1:DNA marker;2:VDR target segment;3-5:Negative control;6:TRPV6 target segment

構建好的質粒測序鑒定發現無任何突變，與目的基因序列一致。用紫外分光光度計測定質粒OD260值，運用公式得到相應拷貝數。VDR質粒拷貝數為1.02×1011拷貝/μL，TRPV6質粒拷貝數為1.06×1010拷貝/μL。分別以這2種質粒做標準曲線。由表2得VDR基因標準曲線方程為Y=-3.810X+33.618，曲線回歸系數R2=0.999，說明VDR標準質粒在這幾個稀釋度范圍內具有良好的線性關系。由表3得TRPV6基因標準曲線方程為Y=-3.212X+42.026，曲線回歸系數R2=0.99，說明TRPV6標準質粒在這幾個稀釋度范圍內具有良好的線性關系。

表2 VDR基因標準品標準曲線數據Table 2 Standard curve data of VDR gene standard

表3 TRPV6基因標準品標準曲線數據Table 3 Standard curve data of TRPV6 gene standard

2.2 小鼠感染H9N2病毒臨床癥狀 小鼠通過滴鼻接種H9N2病毒后第3天出現明顯的臨床癥狀，包括精神沉郁、扎堆明顯、被毛凌亂，體重從接種后第2天就已出現下降(圖3A)，采食減少。接種后4～8 d，小鼠臨床癥狀最為嚴重，基本不采食、消瘦、步態不穩，個別小鼠出現失明、弓背呼吸。感染后第8天，小鼠逐漸恢復采食，體重普遍開始增加，其他癥狀也逐漸減輕；到感染后第14天，小鼠癥狀基本恢復正常，但體重仍較對照組低(P<0.05)。與試驗組相比，對照組的小鼠并未表現出異常癥狀。

肺系數是肺濕重與體重的百分比，是反應肺水腫程度最重要的指標之一。如圖3B所示，與對照組相比，試驗組小鼠的肺系數在感染后第3天較對照組顯著升高(P<0.05)，第7天時最為嚴重，較對照組小鼠的肺系數高3倍左右(P<0.01)，到第14天 仍未恢復到正常水平，較對照組差異顯著(P<0.05)，表明H9N2病毒感染會引起小鼠出現明顯的肺水腫。

圖3 H9N2病毒感染后小鼠體重(A)和肺系數(B)的變化Fig.3 Changes in body weight(A)and lung index(B)of mice infected with H9N2 virus*：P<0.05；**：P<0.01

2.3 小鼠十二指腸組織中VDR和TRPV6 mRNA表達變化VDR基因樣本在實時熒光定量PCR后測得的Ct值代入標準曲線方程得到基因拷貝數，根據基因拷貝數作柱狀圖。從圖4A可以發現：在H9N2亞型禽流感病毒感染后，小鼠十二指腸中的VDR基因表達量與對照組小鼠相比較總體是下調的。感染后的第3天VDR基因表達量已經出現顯著下降(P<0.05)，僅有對照組表達量的1/5，并一直持續到感染后第21天。即在感染后21 d內，小鼠十二指腸內VDR基因表達被顯著抑制。到感染后第28天 時，其基因表達量上升并顯著高于對照組(P<0.05)。從圖4B可以發現：H9N2病毒感染小鼠之后，小鼠十二指腸中TRPV6基因拷貝數的變化趨勢與VDR基因類似，總體是下調的。在感染后第3天，TRPV6基因表達出現下調，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；到第7天表達量達到最低值，僅為對照組表達量的1/2(P<0.05)；在第14天和第21天，表達量仍顯著低于對照組(P<0.05)；到感染后第28天時，TRPV6基因表達量基本恢復到正常水平(P>0.05)。

圖4 小鼠十二指腸組織中VDR(A)和TPPV6(B)mRNA表達變化Fig.4 Changes of VDR(A)and TRPV6(B)mRNA expression in mouse duodenum tissue與對照組比較，*：P<0.05Compared to control group,*:P<0.05

3 討論

有研究表明，H9N2禽流感病毒不經過適應就可以感染實驗小鼠。本課題組用本實驗所用的H9N2病毒毒株感染小鼠，小鼠出現了急性呼吸窘迫綜合征[9]。本試驗用該毒株滴鼻感染小鼠情況基本相似。感染劑量為1×106TCID50時，小鼠沒有出現死亡情況，但癥狀非常明顯。小鼠感染后精神沉郁，被毛雜亂，扎堆，體重下降，肺系數顯著增加，說明肺組織出現明顯水腫、出血。小鼠第3天開始出現明顯癥狀，第7天最為嚴重，到第14天基本恢復，再現了從感染到發病再到痊愈的過程。

鈣離子的總體攝入量主要依賴于腸道吸收。腸道中TRPV6是Ca2+選擇性的離子通道，參與維持體內鈣穩態。TRPV6屬于維生素D依賴性蛋白。活化維生素D進入細胞后和胞漿內VDR結合，隨后VDR和類維甲酸受體X(RXR)形成二聚體，進入細胞核，通過結合DNA上VDR反應原件(VDREs)調控基因的表達[10]。TRPV6基因的啟動子上有多個VDREs，即TRPV6的表達受VDR的調節。有研究表明，VDR基因敲除小鼠腸道中TRPV6表達要比野生型小鼠下降90%左右[11]，腸道鈣主動吸收的水平不足正常水平的30%[12]。本試驗結果發現，H9N2病毒感染后，十二指腸中VDR和TRPV6基因表達均顯著降低，并且影響時間較長，從第3天一直持續到了第21天。小鼠感染H9N2病毒后的感染高峰期在第3～5天，在第5～7天發病最為嚴重，從第7天或第8天開始恢復，到第14天基本恢復。說明小鼠在感染期、發病期、恢復期十二指腸中VDR和TRPV6 mRNA表達均受到顯著抑制，有可能影響VDR和TRPV6蛋白的表達，進而可能影響到十二指腸對鈣離子的吸收。

冬天光照時間短，皮膚合成的維生素D較少，因此機體內維生素D水平較低，進而影響鈣離子的吸收和代謝[13]。而冬天正是流感暴發的高峰期。在維生素D水平較低的情況下感染流感病毒，就可能嚴重影響到腸道鈣離子的吸收。特別是對于兒童和老年人來說，若他們不慎感染了流感病毒，從感染到痊愈甚至更長的一段時間鈣吸收發生障礙，可能會導致嚴重的健康問題，如免疫力低下、心臟病發作等。目前，對鈣代謝影響因素的研究主要集中在飲食、激素、年齡和一些疾病，如高血壓、老年癡呆、糖尿病等，對于病毒感染影響腸道鈣離子的吸收報道很少見[14]。本試驗初步探索了H9N2流感病毒感染對十二指腸鈣離子吸收的影響，希望對病毒感染和鈣代謝的關系起到一定的啟示作用。