離子交換法分離L-絲氨酸的試驗研究

鄭桂花，李世堯，張 婷，崔 雄，張文浩，孫 靜，邱 誠

（1.成都工業學院材料與環境工程學院，成都 611730；2.華中科技大學環境科學與工程學院，武漢 430074）

氨基酸分離方法主要有沉淀劑分離法、離子交換法、膜分離法、吸附法、萃取法等。沉淀法包括特殊試劑沉淀法、等電點沉淀法和有機溶劑沉淀法。特殊試劑沉淀法是最早應用于混合氨基酸分離的方法之一，精氨酸和亮氨酸的特殊沉淀法分離工藝已較為成熟［1］。沉淀法具有簡單、方便、經濟和濃縮倍數高、選擇性強的優點，但是也有沉淀劑回收困難、排放廢液量大、環境污染嚴重等問題，因此沉淀法已逐漸被其他分離方法取代。吸附法選擇性相對較差、收率低，特別是一些無機吸附劑的性能不穩定、不能連續操作、勞動強度大，尤其是活性炭還影響環境衛生。近年來逐漸發展的新型分離技術有超臨界CO2萃取技術、超濾和納濾技術以及液膜技術等，這些新開發的技術取得了很大進展，但也存在工藝不夠成熟、設備精密度不高、難以去除萃取液的毒性、有機溶劑用量大、廢棄溶劑難以回收、生產成本高等諸多問題，在一定程度上限制了其大規模應用。

離子交換法是氨基酸工業中應用比較廣泛的一種分離純化方法，主要根據離子交換樹脂對不同氨基酸吸附能力的差異實現對混合溶液中氨基酸組分或單一組分的分離。根據報道，目前已有很多成功運用離子交換方法分離氨基酸的研究，如余諱等［2］采用732陽離子交換樹脂，從發酵液中分離純化出L-亮氨酸，總提取率達71.28%；Simon等［3，4］利用離子交換熱參數泵成功從水解液和制革廢液中分離濃縮出氨基酸；此外，應用離子交換方法實現分離的氨基酸還有精氨酸（Arg）［5，6］、賴氨酸（Lys）［7］、異亮氨酸（Ile）［8］、酪氨酸（Tyr）［9］、亮氨酸（Leu）［2］、丙氨酸（Ala）［10］、脯氨酸（Pro）［11］、組氨酸（His）［12］、谷氨酸（Glu）［13］、苯丙氨酸（Phe）［1］等。酶法合成L-絲氨酸試驗反應結束后，酶反應液中可能含有甘氨酸和L-絲氨酸，由于甘氨酸和絲氨酸性質相似，等電點接近，溶解度也相差不大，所以二者一直是氨基酸分離領域的難點，基于離子交換法設備要求簡單、易于操作、分離成本低廉、處理量大以及便于大規模進行工業化生產等諸多優勢，本研究選用DIAION PA312陰離子交換樹脂對L-絲氨酸進行分離純化，以期能夠為相關的實踐提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

DIAION PA312樹脂購于三菱化學股份有限公司，D301R陰離子交換樹脂和AB-8大孔吸附樹脂均購于天津南開合成科技有限公司，201×7陰離子交換樹脂購于上海勁凱樹脂有限公司，TEA購于國藥集團化學試劑有限公司，衍生化試劑PITC（＞98%）購于阿拉丁試劑有限公司，乙腈和甲醇由美國Tedia試劑公司生產，甲酸（98%～100%）來自天津光復精細化工研究所。除甲醇和乙腈為色譜純外，其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

RE-52A旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；Agilent 1200譜作站，美國安捷倫科技公司；YM-50高壓蒸汽滅菌鍋，上海三申醫療器械有限公司；ZHWY-2102恒溫培養箱，上海智城分析儀器有限公司；DZF-6020MBE真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；101A-1BY鼓風恒溫干燥箱，杭州藍天化驗儀器有限公司；SHB-3循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；Agilent Eclipse plus C18色譜柱，美國Sigma-Aldrich公司；Agilent1100LC/MSD液質聯用儀，美國安捷倫科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 離子交換樹脂的預處理

1）大孔吸附性樹脂的預處理：將樹脂除雜、過篩，用一定量去離子水漂洗除去浮粒；然后用95%乙醇浸泡24 h，再用小流量去離子水淋洗，洗至流出液不渾濁為止；最后用2～3倍樹脂體積的1 mol/L HCl溶液浸泡3 h，水洗至流出液接近中性，再用2～4倍樹脂體積的2 mol/L NaOH溶液浸泡3 h，去離子水洗至中性。

2）陰離子交換樹脂的預處理：先用自來水浸泡2 h，使其充分膨脹，去除樹脂中的細小顆粒，用去離子水洗至pH為5～6；然后用2 mol/L NaOH溶液浸泡6 h，用去離子水洗去堿液至pH為7.0；再用2 mol/L的HCl溶液連續浸泡6 h，用去離子水洗去酸液至pH為5.5±0.5；最后再次用2 mol/L NaOH溶液轉型處理浸泡6 h，用去離子水洗至pH為7.0，以備使用。

1.3.2 吸附量、吸附率及L-絲氨酸含量的測定方法

1）吸附量和吸附率的測定：準確稱取已經處理好的201×7、AB-8、D301R、DAION PA312樹脂各2 g，置于150 mL的三角瓶中，依次加入20 mL的濃度為10 g/L的L-絲氨酸溶液，于30℃，100 r/min的恒溫搖床中連續振蕩7 h，比較這4種樹脂的靜態吸附容量。離子交換樹脂的吸附量即交換容量，樹脂吸附量與吸附率均是評價樹脂性能的重要指標，吸附量及吸附率公式表示如下：

其中，Q為吸附達到平衡時的樹脂吸附量（mg/g）；E為吸附達到平衡時的樹脂吸附率（%）；C0為吸附前溶液的濃度（g/L）；C為吸附平衡后溶液的濃度（g/L）；V為溶液體積（L）；W為樹脂的質量（g）。

2）L-絲氨酸含量的測定：首先對含有氨基酸的洗脫溶液進行預處理，然后采用異硫氰酸苯酯衍生化處理，最后用HPLC-ESI-MS測定氨基酸含量［14］。

1.3.3 離子交換樹脂靜態交換吸附方法

1）吸附時間對吸附效果的影響：量取2 mL濕樹脂于50 mL三角瓶中，加入50 mL已經處理好的酶促轉化溶液，放入30℃，100 r/min搖床中振蕩一定的時間，每10 min取樣一次，每次取樣10μL，連續取樣2 h，取樣之后對樣品進行衍生化處理，待樣品處理好后進行HPLC分析。

2）上樣溶液pH對吸附效果的影響：準確量取8份25 mL濃度為10 mmol/L處理好的酶促轉化溶液于250 mL三角瓶中，調節樣品溶液的pH，分別使其pH為4、5、6、7、8、9、10、11，每份溶液加入1 mL樹脂，放入30℃，100 r/min搖床中連續振蕩一定的時間，保持樹脂吸附20 min，取樣量為10μL，每組取3個平行樣。

3）樹脂實際交換量的確定：取10 mol/L已經處理好的酶促轉化溶液140 mL，調節溶液pH至9，加入到250 mL三角瓶中，置于30℃，100 r/min的搖床中連續振蕩吸附一定時間，每組取3個平行樣。

1.3.4 離子交換樹脂動態交換吸附方法

1）洗脫劑類型對洗脫效果的影響：裝好層析小柱和樹脂，加入pH為9的酶促轉化混合溶液，采用0.2 mol/L茚三酮檢測流出液，直到流出液遇茚三酮變紫色時停止上樣，保持吸附20 min，去離子水淋洗樹脂至流出液pH至7左右，分別采用0.2 mol/L PBS（pH=5）和0.8 mol/L HCl溶液作為洗脫劑，每1 mL收集一次流出液，連續收集30 mL，取10μL做衍生化處理，待樣品處理好后進行HPLC分析。

2）洗脫流速對洗脫效果的影響：將適量的濕樹脂裝入層析柱，緩慢滴加pH為9的酶促轉化混合溶液20 mL，用茚三酮檢測流出液，直到流出液遇茚三酮變紫色時停止上樣，保持吸附20 min，去離子水淋洗樹脂至流出液pH至7左右，以0.2 mol/L PBS（pH=5）作為洗脫液，分別考察0.3、0.4、0.5 mL/min流速對洗脫效果的影響。

2 結果與分析

2.1 離子交換樹脂的選擇

由圖1可知，DAION PA312陰離子交換樹脂在4.5 h時吸附達到飽和且吸附量相對較大，而AB-8、D301R、201×7樹脂在4.5 h時還未到達飽和，吸附平衡時間較長，通過對比發現DAION PA312陰離子交換樹脂到達平衡時間相對較快，更利于工業化快速操作，所以選擇DAION PA312陰離子交換樹脂為提取純化L-絲氨酸的最佳樹脂。

圖1 不同樹脂對L-絲氨酸的靜態吸附曲線

2.2 吸附時間對吸附效果的影響

由表2可知，隨著吸附時間的延長，樹脂吸附L-絲氨酸的量逐漸增大，10～20 min時樹脂吸附氨基酸的量快速增加，20 min時吸附達到飽和，吸附的L-絲氨酸量為25.07 mg/g；吸附率和吸附L-絲氨酸的量呈現相同的趨勢，隨著吸附時間的增加，樹脂的吸附量變化不大，因此，選擇20 min為樣品上柱后的最佳吸附時間。

圖2 吸附時間對吸附效果的影響

2.3 上樣溶液pH對吸附效果的影響

由圖3可知，樣品溶液的pH為4～9時，樹脂吸附氨基酸的量整體上呈增加的趨勢，吸附率保持持續增加趨勢，pH為9時，樹脂吸附L-絲氨酸的量及吸附率均達到最大值，當pH為9～11時，相應的吸附量和吸附率逐漸下降，因此樣品溶液最適合pH為9。

圖3 上樣溶液pH對吸附效果的影響

2.4 樹脂實際交換容量的確定

由圖4可知，樹脂連續吸附20 min時，吸附L-絲氨酸的量及相應的吸附率一直保持增加的趨勢，20 min后，樹脂吸附L-絲氨酸增加趨勢放緩，基本達到飽和，吸附率基本不再增加，樹脂吸附L-絲氨酸的量約為94.25 mg/g，因此，DAION PA312陰離子交換樹脂的實際交換容量為94.25 mg/g。

圖4 樹脂的實際交換容量

2.5 洗脫劑類型對洗脫效果的影響

由圖5可知，采用0.2 mol/L PBS（pH=5）作為洗脫劑可以將絲氨酸和甘氨酸有效地分離并快速地洗脫下來，整個洗脫過程大約需要35 min，而采用0.8 mol/L HCl作為洗脫溶劑時，分離不夠徹底，洗脫時間相對較長，洗脫曲線有拖尾現象。

圖5 洗脫劑類型對洗脫效果的影響

2.6 洗脫流速對洗脫效果的影響

由圖6可知，洗脫峰主要集中在2～18 min，隨著洗脫速度的逐漸增大，洗脫曲線逐漸收斂，洗脫效果明顯變好。洗脫速度為0.5 mL/min時，洗脫曲線有明顯的拖尾現象，此條件下L-絲氨酸的收率較低；洗脫流速為0.4 mL/min時，洗脫過程進行相對較快，無拖尾現象；洗脫流速為0.3 mL/min時，洗脫劑流速較慢容易導致結柱現象，洗脫周期較長。綜合考慮以上因素，選擇0.4 mL/min為最佳的離子交換洗脫流速。

圖6 洗脫流速對洗脫效果的影響

4 小結

本研究采用離子交換法對酶促轉化合成的產物L-絲氨酸進行提取純化，通過對比4種不同離子交換樹脂的靜態吸附容量，確定選擇強堿性陰離子交換樹脂DAION PA312作為提取純化L-絲氨酸最佳樹脂，該樹脂具有分離范圍廣，可以與各種無機鹽及無機酸發生離子交換，樹脂活化、再生方法簡單等優點。通過對分離純化各個階段的L-絲氨酸含量進行定量分析，確定了最佳的吸附和脫附工藝條件，即吸附條件：上樣溶液pH=9，吸附時間為20 min，實際交換容量為94.25 mg/g；脫附條件：洗脫液為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH=5），洗脫流速為0.4 mL/min。