煙草青枯病拮抗菌的分離篩選與抑菌活性物質研究

湯鳴強，林天然，李小芳，周曉勤，曾文龍，林曉路，彭水蓮

（1.福建師范大學福清分校海洋與生化工程學院，福建 福清 350300；2.現代設施農業福建省高校工程研究中心，福建 福清350300；3.福建省煙草公司龍巖市公司，福建 龍巖 364000；4.龍巖市煙草公司長汀分公司，福建 長汀 366300）

煙草青枯病是一種土傳性細菌病害，由青枯雷爾氏菌（Ralstoniasol anacearm）侵染而引起［1］。該病菌株系表現型與基因型多樣化，對環境適應能力強，可感染250多種植物［2］。煙草青枯病普遍發生于中國長江流域及其以南地區，近年來福建、廣東及云南等局部地區均發生過嚴重的病害，平均發病率高達30%～85%，使得煙草產量和品質下降［3］，在部分重病區經常導致全田發病、絕產無收。

國內外學者對煙草青枯病的防治開展了廣泛的研究，涉及栽培管理、抗病品種選育、化學藥劑防治和生物防治等方面。其中，化學藥劑防治仍是控制煙草青枯病的主要技術手段［4，5］，但長期大量使用化學藥劑容易導致病原菌抗性增加，并造成環境污染和農產品有害物質殘留超標。生物防治具有經濟、無公害、效果長久等優點，符合農業可持續發展的要求，其中拮抗放線菌及其代謝產物的分離篩選一直是植物病害生物防治的重要內容，對煙草生產和生態環境保護意義重大［6］。張薇［7］從土壤中篩選到一株放線菌Y23對煙草青枯病菌表現出較好的抑制效果，其抑菌圈直徑達13.4 mm，菌株產生的抗菌物質對紫外光和熱穩定性較好。陸錚錚等［8］采用平板對峙培養法，分離篩選到3株煙草青枯病菌拮抗放線菌，分別為玫瑰暗黃鏈霉菌、橄欖綠鏈霉菌和黃麻鏈霉菌。羅文建等［9］從健康煙田根際土壤中分離到對青枯雷爾氏菌具有明顯拮抗作用的鏈霉菌LC-7，該菌株對煙草青枯病具有顯著的防治效果，防效為85.48%。

本研究從福建省龍巖市上杭縣煙區健康煙株根際土壤分離到多株青枯病拮抗放線菌，其中，菌株FQ-7的拮抗活性最強，通過形態培養特征觀察、生理生化試驗及16S rDNA序列測定，確定菌株FQ-7的分類地位。菌株FQ-7發酵液提取物經萃取濃縮，研究其在不同溫度、不同pH及不同紫外光照射時間下的穩定性，為該菌株應用于煙草青枯病的生物防治提供新的資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤樣品 采自福建省龍巖市上杭縣下枋村煙區健康煙草周圍的土壤，采集時間為2019年5月。對土壤樣品進行適當的處理后，將其用無菌樣品袋密封，做好標記，放入冰箱4℃保存備用。

1.1.2 供試病原菌與煙草品種 煙草青枯病菌XQ23菌株分離自福建省龍巖市上杭縣廬豐畬族鄉煙田土壤，分離菌株置于25%甘油中，-80℃保存。供試煙草品種為云煙87，由福建省煙草公司龍巖市分公司提供。

1.1.3 培養基 種子培養基每升含可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g。發酵培養基每升含大豆粉30.0 g，可溶性淀粉20.0 g，CaCO32.0 g，NaCl 2.0 g。營養肉湯（NA）培養基每升含牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，pH 7.0～7.2。菌株形態培養觀察以及生理生化試驗所用培養基參照文獻配制［10-12］。

1.2 拮抗菌的分離與篩選

1.2.1 拮抗菌分離 按照稀釋分離法制備土壤懸液并進行稀釋，制成不同稀釋度的土壤懸液。吸取不同稀釋度的土壤懸液于高氏一號培養基平板上，均勻涂布，置于28℃恒溫培養4 d。選擇干燥、不透明、表面呈緊密絲絨狀的單菌落劃線接種于高氏一號培養基平板上，分離純化3～5次，得到9株放線菌菌株，依次編號為FQ-1至FQ-9，純化后置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 拮抗菌的篩選 以煙草青枯病菌XQ23菌株為靶標菌，采用雙層瓊脂法篩選拮抗菌。供試菌株經活化后接種于高氏一號培養基平板上，28℃恒溫培養5 d，取菌塊置于平板中央。每菌株3次重復，28℃定殖培養4 d。取15 mL經活化的含有煙草青枯病菌XQ23的NA培養基，覆蓋于上述平板。以不加拮抗菌菌塊為對照，置于28℃恒溫培養1 d后觀察抑菌情況。將初篩得到的拮抗菌接種于20 mL種子培養基中，28℃、180 r/min培養24 h作為種子液。取3 mL種子液移入基礎發酵培養基中培養6 d（28℃、200 r/min），離心10 min（4℃、8 000 r/min），上清液經0.22μm濾膜過濾除菌后備用。用瓊脂擴散法測定其抑菌活性，即將煙草青枯病菌制成菌懸液加入到NA培養基中，混合均勻，倒成平板，凝固后用無菌打孔器在含菌平板中打孔，每孔中加入拮抗菌發酵液100μL，28℃恒溫培養24 h后測量抑菌圈直徑，每個處理重復5次。

1.3 拮抗菌的鑒定

觀察描述菌株FQ-7在光學顯微鏡和掃描電鏡下的形態特征。參照文獻［11，13］，進行菌株FQ-7培養特性和生理生化試驗。菌株FQ-7 16S rDNA序列測定參照葉海霞等［14］的方法。PCR擴增產物經電泳檢測后，送科標技術（青島）研發中心進行雙向測序。測序結果經在線分析，同GenBank中的有關序列進行同源性比對并構建系統進化樹。

1.4 拮抗菌FQ-7抗菌活性物質分離及其特性

1.4.1 抗菌活性物質的分離 拮抗菌FQ-7在種子培養基活化培養24 h后移入液體基礎發酵培養基中培養6 d（200 r/min），發酵液經離心取上清液（4℃，8 000 r/min），上清液與乙酸乙酯按照1∶1比例振蕩混合1 h后靜置萃取，將所得萃取液合并濃縮至5倍濃度，經0.22μm濾膜過濾后即為粗提液。

1.4.2 拮抗菌FQ-7抗菌活性物質的檢測 參照“1.2.2”描述的瓊脂擴散法檢測不同處理下拮抗菌FQ-7抗菌活性物質的抑菌效果。每個處理重復5次，28℃恒溫培養24 h，用無菌水作陰性對照，30 μg/mL慶大霉素作陽性對照。

1.4.3 拮抗菌FQ-7抗菌活性物質的穩定性分析大量制備拮抗菌FQ-7發酵液，按照“1.4.1”的方法，獲得抑菌活性物質乙酸乙酯萃取物，經適當濃縮后將 其 置 于 不 同 溫 度（40、60、80、100、110、115、121℃）、不同pH緩沖體系（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0）和不同紫外燈照射時間（30、60、120 min），功率8 W，燈距20 cm處理，采用瓊脂擴散法檢測拮抗菌FQ-7抗菌活性物質的抑菌效果，以30μg/mL硫酸慶大霉素為對照，考察其對熱、pH和紫外光處理的穩定性。相對抑菌活性=（處理組抑制菌直徑/對照組抑菌圈直徑）×100%。

1.5 數據處理與分析

采用Origin 9.1作圖，數據統計分析利用SPSS 17.0軟件完成，利用LSD多重比較法檢測處理間差異顯著性，顯著性水平設定為P＜0.05。數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的分離

采用稀釋涂布法從健康煙株根際土壤中分離得到9株放線菌，用雙層瓊脂法進行初篩。試驗結果表明，菌株FQ-7對煙草青枯病菌有明顯的抑制效果，抑菌圈直徑可達16.3 mm（圖1A）。

2.2 拮抗菌FQ-7形態特征

將拮抗菌FQ-7接種于高氏一號固體平板上，28℃培養7 d。菌落形態特征：干燥、不透明，表面呈緊密的絲絨狀，上面有一層淺藍色的粉狀孢子。菌落與培養基連接緊密，難以挑取。該菌分泌水溶性色素，菌落表面呈淡藍色，色素滲透入培養基，變成深藍色（圖1B）。光學顯微鏡下，該菌基內菌絲透明且較細，氣生菌絲顏色較暗，直徑較粗，呈淡青色。孢子絲波曲形，孢子絲成熟后形成的孢子鏈呈串珠狀，表面光滑（圖1C）。掃描電鏡下可見拮抗菌FQ-7產短棒狀分生孢子，表面光滑，分生孢子大小為（0.9～1.1）μm×（0.6～0.8）μm（長×寬）（圖1D）。

圖1 拮抗菌FQ-7的拮抗效果與形態特征

2.3 拮抗菌FQ-7培養特征

2.3.1 培養特征 拮抗菌FQ-7在供試的5種培養基上都能生長，其中，在燕麥粉瓊脂培養基和高氏一號培養基上生長最好，其次是酵母精麥芽糖精瓊脂和無機鹽淀粉瓊脂培養基。該菌在馬鈴薯浸汁培養基上生長最差，在5種供試培養基上形成不同特點的氣生菌絲和基內菌絲，其可溶性色素的顏色也略有差異（表1）。

表1 拮抗菌FQ-7在不同培養基上的培養特征

2.3.2 菌株FQ-7的生理生化特性 該菌為兼性好氧型，接觸酶、甲基紅試驗陰性，能分解淀粉與酪素，不耐鹽，在10 g/L時生長速度最快。該菌能利用葡萄糖、甘露醇、蔗糖和麥芽糖，不能利用乳糖、纖維二糖、山梨醇和甜醇。

2.4 拮抗菌FQ-7 16S rDNA分析

16S rDNA序列測序結果表明，FQ-7的16S rDNA序列長度為1 484 bp。將該序列在GenBank中進行Blast檢索，發現菌株FQ-7與鏈霉菌屬（Strept omyces）菌株相似性最高，說明該菌株可能是鏈霉菌屬的成員。系統發育樹結果（圖2）顯示，FQ-7與菌株Streptomyces violaceolatus（KT363060）聚在同一分支上，同源性在99%以上。結合菌株FQ-7的形態培養特征、生理生化試驗鑒定和16S rDNA序列系統發育分析，菌株FQ-7鑒定為紫邊鏈霉菌（Streptomyces violaceolatus），命名為Streptomyces violaceolatusFQ-7。

圖2 菌株FQ-7基于16S rDNA序列構建的系統發育樹

2.5 發酵液活性物質研究

2.5.1 熱穩定性 由圖3可知，菌株FQ-7發酵液乙酸乙酯提取物經100～121℃熱處理后，其抗菌活性均無顯著性差異。在40～121℃，隨著處理溫度的升高，抑菌圈直徑為7.8～8.3 mm，相對抑菌活性保持在88.51%～95.40%，說明FQ-7菌株產生的抗菌物質熱穩定性較好。

圖3 溫度對菌株FQ-7抑菌活性的影響

2.5.2 酸堿穩定性 由圖4可知，菌株FQ-7發酵液乙酸乙酯提取物抑菌活性在酸性和中性條件下比較穩定，且隨著pH的升高，其抑制菌活性有逐漸下降的變化趨勢。在試驗pH范圍內（pH 2.0～8.0），其抑菌圈直徑為7.5～8.7 mm，相對抑菌活性保持在86.52%～99.88%，說明FQ-7菌株產生的抑菌物質具有較好的酸堿穩定性。

圖4 pH對菌株FQ-7抑菌活性的影響

2.5.3 紫外光穩定性 由圖5可知，隨著紫外光照射時間的延長，菌株FQ-7發酵液乙酸乙酯提取物抑菌活性呈逐漸減弱的變化趨勢。照射30～120 min，其抑菌圈直徑為7.4～7.9 mm，相對抑菌活性保持在85.52%～91.05%，說明該菌株所產生的抑菌物質對紫外光照射的穩定性較好。

圖5 紫外光對菌株FQ-7抑菌活性的影響

3 小結與討論

植物根系周圍分布有種類多樣的微生物，根際環境是植物微生物互作的區域，其中，根際放線菌可誘導植物抗病性，激發耐旱能力或作為生防制劑［15］。有文獻報道，這些放線菌可以通過產生抗菌物質、降解酶或揮發性物質等途徑抑制植物病原菌的生長［16］。人類已發現的抗生素多數來源于放線菌，特別是鏈霉菌屬放線菌［13］。當前，放線菌次級代謝產物研究的一個重要方向就是從中發現一些有應用潛力的農用抗生素及其產生菌，用于植物病害的防治［17］。羅文建等［9］從鏈霉菌LC-7中分離到一種新的氨基糖苷類抗生素，對煙草青枯病有顯著的防治效果。Prabavathy等［18］研究Stre ptomycessp PM5對稻瘟病菌和水稻紋枯病菌的防控作用，發現該菌產生的2種脂肪族化合物有明顯效果。李慶蒙［19］研究指出，Stre ptomycesPM5對煙草黑脛病菌、水稻稻瘟病菌和根霉等多種作物病原真菌具有生物活性，其抗菌物質對熱處理、光照射及酸堿處理的穩定性較好。

本研究對生防菌Streptomyces violaceolatusFQ-7進行了形態培養特征觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列聚類分析，最終鑒定為紫邊鏈霉菌。紫邊鏈霉菌是土壤中常見類群［20，21］，但在生態系統中的功能了解較少。杜靜［22］應用三重抗生素抗性篩選方法，從四川、湖北、山東、遼寧和黑龍江5省的土樣中分離得到4株鏈霉菌，其發酵粗提物對藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌及9種植物病原真菌表現出不同程度的抑制活性。其中，49號菌株同Streptomyces violaceolatus的相似性為99%，其發酵液上清液和菌體浸提液對甜椒菌核病菌、水稻紋枯病菌和黃瓜黑星病菌3種病原真菌的菌絲生長抑制率均在90%以上，但其發酵粗提物對溫度的穩定性較弱，當溫度達30℃時，其抑菌活性完全喪失。Hayakawa等［23］發現Streptomyces violaceolatusA32產生的3種異硫脲抗生素對革蘭氏陽性菌有顯著的抑菌效果，但對革蘭氏陰性菌及真菌沒有生物活性。還有研究發現分類上與Streptomyces violaceolatus相近的菌株Streptomyces violaceolatusA3產生放線菌紫紅素（Actinorhodin）、次甲霉素（Methylenomycin）、十一烷基靈菌紅素（Undecylprodigiosin）和鈣依賴型抗生素［24］。Streptomyces violaceolatusFQ-7對營養和環境條件要求較低，分離簡便，抑菌活性物質對熱、pH和紫外光照射穩定性強，表明該菌在生防方面潛在的應用價值，為青枯病菌的生物防治提供了新的微生物資源。