紅藤化學(xué)成分中端粒酶TERT基因激動劑的虛擬篩選

湯 建，徐瀅瀅，黃淑慧，劉 夢，曹裕旻，聞崇煒*

（1.亳州學(xué)院中藥學(xué)院，安徽亳州 236800；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

紅 藤（Sargentodoxacuneata（Oliv.） Rehd. et Wils.），又稱大血藤，是一種我國特有的植物，中醫(yī)臨床常用于治療闌尾炎、月經(jīng)不調(diào)等。紅藤提取物或紅藤復(fù)方有良好的抗炎免疫等藥理活性［1］。迄今已分離鑒定120 余種小分子化合物，主要包括酚酸類、苯丙素（木脂素）類、三萜、黃酮類等［2-3］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)紅藤提取物具有激活端粒酶的作用，但其中活性成分尚不明確。

端粒酶是細(xì)胞中負(fù)責(zé)染色體端粒延長的一種DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶，其抑制劑可作為一類潛在的高選擇性抗癌藥物［4］；反之，激活端粒酶有助于端粒穩(wěn)定，是延長細(xì)胞壽命、抗衰老的有效手段之一［5-6］。端粒酶中的逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）是其限速亞單位，是調(diào)節(jié)端粒酶活性的關(guān)鍵基因［4-5，7］。端粒酶特異性的抑制劑BIBR1532 就是通過和TERT 結(jié)合而發(fā)揮藥理活性的［8］。目前，TERT 被認(rèn)為是癌癥靶向治療高選擇性的目標(biāo)靶位，以TERT 為靶點(diǎn)的抗癌藥物分子設(shè)計(jì)被廣泛研究報(bào)道［4，7］。但通過激活TERT 來提高端粒酶活性的研究較少，目前僅報(bào)道過環(huán)黃芪醇等少數(shù)天然產(chǎn)物可以通過激活端粒酶發(fā)揮抗衰老作用［6，9］。中藥中的某些成分可能通過上調(diào)TERT，激活端粒酶，具有穩(wěn)定端粒、抗衰老的潛力，值得深入研究。

分子對接（Molecular docking）作為一種高效的輔助篩選手段，在中藥活性成分篩選和靶點(diǎn)確證方面有著廣泛的應(yīng)用前景。針對某一特定的靶點(diǎn)蛋白，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對中藥化合物庫進(jìn)行虛擬篩選，尋找與靶蛋白結(jié)合密切的候選化合物，進(jìn)而采用生物模型測定其藥理活性，最終篩選出具有活性的化合物［10-11］。為了發(fā)現(xiàn)紅藤中潛在的抗衰老活性化合物，本研究中采用AutoDockVina 軟件［12］，將檢索到的紅藤化合物（配體）與TERT 基因（受體）進(jìn)行分子對接，根據(jù)結(jié)合能（打分值）虛擬篩選出潛在的端粒酶激活劑，也為闡明紅藤的抗衰老活性機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

采用ChemOffice2020中的ChemDraw和Chem3D模塊（PerkinElmer 公 司），AutoDock Tools1.5.6 和AutoDockVina（The Scripps Research Institute），Pymol 1.8（DeLano Scientific LLC 公司）和Discovery Studio 2017R2 client（BIOVIA公司）等軟件。

1.2 化合物結(jié)構(gòu)的處理

ChemDraw 繪制紅藤中126 個小分子化合物［2-3］的化學(xué)結(jié)構(gòu)，采用Chem3D 模塊進(jìn)行MM2 處理，保存為mol2 格式。AutoDock Tools1.5.6 進(jìn)一步處理上述配體，扭度（Torsion）設(shè)為默認(rèn)值，最終保存為pd?bqt格式，以備分子對接。

1.3 靶標(biāo)蛋白TERT結(jié)構(gòu)的獲取和預(yù)處理

通過檢索PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org），獲取靶點(diǎn)蛋白TERT 復(fù)合物（PDB ID：5CQG），將靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入AutoDock Tools1.5.6 中，刪除原配體BI?BR1532 和水分子，加氫，保存為pdbqt 格式，利用AutoDockVina 軟件進(jìn)行半柔性對接，得到配體分子與靶點(diǎn)蛋白5CQG 對接后的結(jié)合能。將較高結(jié)合能（絕對值≥8.5 kcal/mol）的化合物認(rèn)定為潛在的活性成分。

用AutoDock Tools1.5.6 軟件將靶點(diǎn)蛋白晶體復(fù)合物中的原配體取出，再與受體重新對接，其結(jié)合能為閾值。同時分析對接構(gòu)象和原蛋白晶體結(jié)構(gòu)中構(gòu)象的重疊度。通常認(rèn)為均方根偏差（RMSD）在2?范圍內(nèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子對接參數(shù)的確定

通過多次分子對接計(jì)算以達(dá)到滿足參數(shù)合理性的要求，確定了各受體蛋白對接晶格中心（x =24.667 nm，y = 6.99 nm，z = -31.485 nm），對接空間（Grid Box）：30 nm × 30 nm × 30 nm，能量范圍為4。

2.2 分子對接的結(jié)果

化合物（配體）與靶點(diǎn)蛋白5CQG 對接后得到126組結(jié)合能數(shù)值，均選擇第一行（即dist from rmsdl.b.值和best mode rmsdu.b.值均為0）的打分值。由圖1 可見，126 個化合物與5CQG 的結(jié)合能與結(jié)構(gòu)有明顯的相關(guān)性。其中酚酸類化合物（1～48）的結(jié)合能范圍是-8.4～-5.6 kcal/mol；苯丙素（木脂素）類化合物（49～97）的結(jié)合能相對集中，范圍是-8.8～-6.4 kcal/mol，其中三個結(jié)構(gòu)類似的酰胺類木脂素sar?gentodognans F2（85）、sargentodognans F（86）和sar?gentodognansG（87）的結(jié)合能是該類化合物中最高的，均為-8.7 kcal/mol；三萜及其他類化合物（98～126）的結(jié)合能范圍是-9.5～-5.5 kcal/mol，其中6 個化合物的結(jié)合能絕對值大于9 kcal/mol。黃酮類化合物（2R）-maesopsin-6-O-β-D-glucoside（111）和大黃素類化合物（113～117）具有較高的結(jié)合能。其中最高的是大黃酚（114），結(jié)合能為-9.5 kcal/mol，但仍弱于原配體BIBR153的-10.9 kcal/mol（表1）。

圖1 5CQG與126個化合物的結(jié)合能散點(diǎn)圖Fig. 1 Scatter plot on affinity scores of 5CQG docking with compounds

表1 5CQG與17個化合物的結(jié)合能（絕對值≥8. 5 kcal/mol）Table 1 Affinity scores of 5CQG docking with 17 compounds（Absolute value ≥8. 5 kcal/mol）

以化合物111 和114 為代表進(jìn)一步分析對接的效果。3D 圖顯示化合物111和114的分子剛好卡在蛋白5CQG 的凹槽內(nèi)（圖2A 和2B）；進(jìn)一步分析其2D 圖，可見大黃酚與氨基酸殘基MET483 形成范德華力；蒽醌環(huán)與TYR551、PHE494 形成Pi-Pi 鍵，與ILE550 形成Pi-Alkyl 鍵，與ARG486 形成Pi-Cation鍵，與MET482 形成Pi-Sulfur 鍵；甲基分別與TYR551、LEU554、MET482、ILE497、PHE494 形 成Akyl 鍵，與PHE478 形成Pi-Alkyl 鍵（圖2D）。化合物111 與殘基TRP498、ILE497、MET483、ARG486、ASP556 和SER560 形成范德華力；黃酮A 環(huán)與LEU554 形成Pi-Alkyl 鍵；B 環(huán)與ILE550 形成Pi-Al?kyl鍵，與PHE494、TYR551形成Pi-Pi鍵，與MET482形 成Pi-sulfur 鍵；2-OH 與ILE550，糖6-OH 與ARG561，糖環(huán)中O 與ARG557 皆形成氫鍵，但糖6-OH 的H 與ARG557 之間存在斥力；糖的端 基C 與GLY553 之間有碳?xì)渥饔茫▓D2C）。這兩個化合物與周圍的氨基酸殘基結(jié)合緊密，存在著明顯的作用力，有助于與TERT的結(jié)合。

圖2 5CQG與化合物111（A，C）和114（B，D）的分子對接圖Fig. 2 5CQG docking digram with compounds 111（A，C），114（B，D）

3 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)紅藤乙醇提取物的水溶性部位具有較好的激活端粒酶活性（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。為了全面檢測紅藤中潛在的激活端粒酶的化學(xué)成分，我們檢索了已經(jīng)報(bào)道的紅藤化合物成分，最終確定了126 種小分子化合物，其中包括紅藤揮發(fā)油中含量超過10% 的δ-蓽澄茄烯（122）和α-杜松醇（123）兩種化合物［13］。這些化合物以酚酸、苯乙醇類、苯丙酸類及木脂素類化合物居多，而三萜類、黃酮類和醌類化合物含量較少［2］。

據(jù)報(bào)道，大黃酚、大黃素等化合物具有良好的抗衰老活性［14］，這一點(diǎn)與本次的分子對接結(jié)果一致。在后續(xù)的藥理研究中，將進(jìn)一步驗(yàn)證本次對接中結(jié)合能最高的大黃酚、大黃素等化合物的端粒酶調(diào)節(jié)活性。分子對接環(huán)節(jié)的分值較高，只說明化合物與TERT 的結(jié)合力較強(qiáng)，但不能確定是激活劑還是抑制劑，這需要藥理試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

考慮到紅藤水溶性部位的主要成分應(yīng)該是較大極性化合物，因此推斷其激活端粒酶的有效物質(zhì)可能是紅藤中的含量豐富且極性較大的酚苷、苯丙素（如：綠原酸）等成分。這一推測與本次對接部分結(jié)果一致，一些苯丙素類化合物與蛋白5CQG 確有較高的結(jié)合能力，其中對香豆酸-4-O-β-D-葡萄糖苷（51）、綠原酸（59）、丹酚酸B（70）的結(jié)合能均為-8.5 kcal/mol（圖1）。這也與藥理活性研究結(jié)果一致：綠原酸能夠顯著延緩秀麗隱桿線蟲的衰老，并增強(qiáng)其抗氧化能力［15］；丹酚酸B 通過抗氧化和保護(hù)線粒體DNA，對D-半乳糖致衰老小鼠具有良好的對抗作用［16］；化合物51的苷元部分香豆酸亦具有良好的抗氧化和神經(jīng)保護(hù)活性［17］。后續(xù)的試驗(yàn)中也會采用多種生物模型考察這些苯丙素類化合物的抗衰老活性和端粒酶調(diào)節(jié)機(jī)制。但酚苷類化合物與蛋白5CQG 的對接值普遍較低，均未超過-8.5 kcal/mol，這與上述推測不盡一致，這可能與該類分子體積較小，在分子對接過程中，不能與所處位置的氨基酸殘基有較強(qiáng)的結(jié)合有一定的關(guān)系。