奧氮平下調SD大鼠棕色脂肪產熱基因UCP1介導代謝綜合征的分子機制

陳小英，彭碧佳，謝文潔，鄧然兮，吳利玲

(1.川北醫學院第二附屬醫院；2.川北醫學院精神衛生學院；3.川北醫學院臨床醫學系；4.南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床學院藥學部·個體化藥物治療南充市重點實驗室，四川 南充 637000)

奧氮平是臨床治療精神分裂癥和其他嚴重精神疾病最常用的處方藥之一。由于精神藥物治療周期長，奧氮平長期服用會顯著增加體重及誘發代謝綜合征[1-2]，從而極大降低臨床治療依從性，導致病情反復甚至治療抵抗，研究其介導代謝紊亂的副作用機制是臨床治療亟需解決的重要現實問題。肥胖是由于體內過量脂肪的堆積所致，脂肪組織包含兩種不同類型的脂肪細胞，即白色脂肪細胞和棕色脂肪細胞。白色脂肪細胞通過甘油三酸酯的形式存儲化學能，而棕色脂肪細胞能夠解耦電子梯度，生成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)促進能量消耗[3]。在嚙齒類動物中，棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)存在于肩胛間，腎周和腹主動脈區域。既往研究認為，人類僅嬰兒期肩胛處存在BAT負責新生期體溫維持并隨著年齡的增加逐漸退化。近年熱成像研究表明，在成年人頸背部也有多個離散區域存在代謝活躍的棕色脂肪組織[4]并且在維持機體能量平衡中發揮了重要作用。

棕色脂肪細胞通常比白色脂肪細胞的直徑小，并且由幾個小的脂滴組成，它們的細胞質中含有大量的線粒體，通過線粒體內膜上的解偶聯蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)發揮作用。UCP1是負責棕色脂肪產熱的線粒體載體蛋白，其通過催化脂肪酸激活的嘌呤核苷酸敏感的質子滲漏穿過棕色脂肪的線粒體內膜而介導機體的非顫抖性產熱，棕色脂肪有助于在長期暴露于寒冷環境期間維持體溫平衡，是棕色脂肪的主要生理功能[5]。研究[6]顯示，UCP1消融的小鼠體重比野生型高50%以上，UCP1基因缺陷小鼠不能經高脂飲食誘導產熱。棕色脂肪功能的喪失與肥胖癥和代謝性疾病密切相關，奧氮平作為第二代抗精神病藥物，臨床應用中可出現過度鎮靜，打破能量平衡導致肥胖甚至嚴重的代謝紊亂等副作用，但其是否通過抑制棕色脂肪產熱導致能量失衡性代謝紊亂目前尚未有研究證明[7]。因此，本研究通過觀察奧氮平長期慢性給藥后對大鼠體重、血脂生化、棕色脂組形態、產熱活性的影響，結合分子生物水平分析棕色脂肪組織中UCP1、PRDM16、AMPK及β3-AR等相關產熱基因的表達變化。進一步通過C3H10T1/2間充質干細胞定向分化的棕色脂肪細胞體外模型探索奧氮平對棕色脂肪細胞發育分化的影響和標記蛋白UCP1的變化等多個方面來考察奧氮平引起能量代謝紊亂的分子機制，為臨床抗精神病藥介導代謝綜合征的干預提供新的理論靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及細胞 SPF級雌性SD大鼠購自于上海國家實驗動物工程中心，體重180～220 g；小鼠間充質干細胞系C3H10T1/2購自于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 實驗藥品及試劑 體內實驗所用奧氮平購自江蘇豪森(歐蘭寧，10 mg/片)；體外實驗所用的奧氮平購自大連美侖生物技術有限公司(貨號:MB1171)。甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、游離脂肪酸(FFA)含量測定試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司。Anti-UCP1(santa cruz biotechnology，貨號：SC-518024)、Anti-PRDM16(santa cruz biotechnology，貨號：ab3789)、Anti-AMPK(cell signaling technology，貨號：2603)、Anti-β3-AR(ybio，貨號：YB-19876)、Anti-GAPDH(bioss，bs-0755R)抗體及二抗(Bioss，貨號：bs-0311P-HRP)用于蛋白免疫印跡和免疫熒光實驗，并通過化學發光(ECL)試劑(bio-rad laboratories，lnc)接收檢測熒光信號。RIPA蛋白提取液購自北京鼎國昌盛生物公司(#WB-007)；將UCP1、PRDM16、AMPK和β3-AR與GAPDH的相對蛋白表達用正常組的表達水平標準化，并使用Image J圖像分析軟件定量分析。MEM細胞培養基(hyclone)購自江蘇凱基生物技術股份有限責任公司，澳洲胎牛血清(cellMax)購自賽澳美細胞技術有限公司。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、0.25%胰酶消化液(含EDTA)購自北京鼎國昌盛生物公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素-鏈霉素溶液、熒光二抗Anti-Mouse IgG-FITC購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與處理 SD大鼠適應環境7 d，為更好地模擬臨床口服藥物方式，對大鼠進行主動進食訓練，通過將水與載體(含有40%的玉米淀粉，30%的蔗糖，15%的明膠，13%的酪蛋白，2%礦物油)混合制成空白糖丸或與藥物糖丸(奧氮平片劑粉碎后與糖丸混合)[8-10]。禁食24 h，不禁飲，第2天將空白糖丸按照后期給藥時間點(8∶00、15∶00和23∶00)給藥，連續訓練主動進食7 d后隨機分為空白對照組和奧氮平給藥組，每組各12只。按上述時間點連續28 d口服奧氮平(1 mg/kg，3次/d，根據Meeh-Rubner公式按照體表面積進行等劑量換算)，空白對照組同法給予等量的糖丸(以大鼠體重計算實際給藥量)。給藥期間，1次/4 d記錄體重、攝食情況，分別于第1周和4周對大鼠肩胛處溫度進行檢測。動物給藥方案見圖1。

1.2.2 大鼠血清收集及血脂檢測 給藥結束后，處死前將大鼠禁食4 h，在處理之前再給予一次藥丸，2 h之內將大鼠解剖，3%戊巴比妥麻醉后腹主動脈采血，4℃環境下冷凍高速離心機中1 500 rpm離心20 min，取上層血清于干凈的EP管中，TG、TC、LDL、HDL及FFA的檢測嚴格按照試劑盒說明書操作進行檢測。

1.2.3 大鼠白色和棕色脂肪組織切片染色(HE染色) 取大鼠棕色脂肪、白色脂肪、肝臟及腎臟稱重并記錄，取一半棕色及白色脂肪組織用4%多聚甲醛固定，染色前先用二甲苯脫去切片中的石蠟，用高濃度至低濃度的酒精洗脫，并用蒸餾水洗滌1～2 s。蘇木精染色(60℃)30～60 s，流水沖洗蘇木精5～10 s，1%鹽酸乙醇清洗1～3 s，水洗1～2 s，促藍液反藍5～10 s，流水沖洗15～30 s。0.5%伊紅染色30～60 s，蒸餾水清洗1～2 s，80%乙醇1～2 s，95%乙醇1～2 s，無水乙醇1～2 s，石碳酸二甲苯2～3 s，二甲苯(I)2～3 s，二甲苯(II)2～3 s。將已透明的切片滴上封片劑，蓋上蓋玻片封固，用顯微鏡拍照儲存。

1.2.4 Western blot 取大鼠BAT樣本約30 mg，每管加入0.2 mL含1 %的蛋白酶抑制劑和1%的磷酸化酶抑制劑的RIPA(ripa lysis buffer)裂解液，置于均質破碎機使其充分破碎(4.0 M/S，20 s/次，間隔5 min，破碎3次)。將裂解產物4℃，12 000 rpm，離心10 min，取中間層蛋白液，BCA法定量蛋白質濃度，所有樣品加入上樣緩沖液(5×，loading buffer)后在100℃下煮沸10 min。通過SDS-PAGE分離蛋白質，并轉移至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，15 min/次；加入二抗室溫孵育2 h；TBST洗滌后，ECL試劑盒曝光成像，Image J軟件對得到的灰度值進行分析。

1.2.5 棕色脂肪細胞的定向分化 C3H10T1/2細胞采用MEM基礎培養基(含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素溶液)，于37℃、5% CO2培養箱中培養。將C3H10T1/2細胞培養至鋪滿培養約70%，消化細胞后稀釋至濃度為5×104個/mL接種至12孔板正常培養。將生長到100%匯合的C3H10T1/2細胞，分化經常開始于在細胞鋪滿后1～2 d。用含有10 %胎牛血清培養基的脂肪細胞誘導分化劑(MDI+Indo+T3+Ros)：0.5 μM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、1 μM地塞米松(Dexa)、850 nM胰島素(insulin，Ins)、125 nM吲哚美辛(Indo)、1 μM羅格列酮(Ros)和1 nM三碘甲狀腺氨酸(T3)處理48 h；之后更換含有10 %胎牛血清(FBS)，850 nM Ins、1 μM羅格列酮(Ros)和1 nM三碘甲狀腺氨酸(T3)的培養基(棕色脂肪培養液)繼續培養，每2天更換1次。在該培養基中再過6 d左右，細胞表現出具有大量脂質積聚完全分化的表型[11]。見圖2

1.2.6 油紅染色 待細胞長至接觸抑制時，更換為含藥的誘導分化液，設置空白對照組、奧氮平組(奧氮平終濃度10 μM)，即在細胞分化期慢性處理細胞6 d，1次/2 d更換誘導液，棄去培養上清，用PBS溶液洗2～3次。用4%多聚甲醛溶液在37℃下固定30 min，然后用PBS溶液洗滌兩次。加入新配置過濾好的油紅O溶液，于37℃下完全浸泡細胞90 min。棄去油紅溶液，用PBS溶液徹底清洗殘留的油紅溶液。蘇木素染液復染細胞核2 min，用PBS溶液徹底清洗殘留的油紅溶液(至少洗4次)，在倒置顯微鏡下觀察脂肪細胞的分化并拍照。棄掉孔板中的PBS，用異丙醇500 μL/孔充分溶解細胞中著色的脂滴，吸取到96孔板中，在490 nm波長下測定其吸光度值(OD)，并計算細胞中儲存的甘油三酯(TG)的相對含量。

1.2.7 免疫熒光染色 待細胞長至接觸抑制時更換為含藥的誘導分化液，設置空白對照組、奧氮平組(奧氮平終濃度10 μM)，即在細胞分化期慢性處理細胞6 d，1次/2 d更換誘導液，待細胞分化結束后進行免疫熒光染色，分化結束的細胞用PBS浸泡并清洗3～4次，約5 min/次。用4%的多聚甲醛固定15 min，隨后用PBST清洗細胞3次，5 min/次。配置0.25%的Triton X-100，室溫下通透15 min左右，用PBST清洗3次，5 min/次，加入1%BSA，室溫下封閉1.5 h。吸出封閉液，每孔加入足夠量稀釋好的一抗(1∶50)，4℃孵育過夜。回收一抗，用PBST浸泡并清洗3～4次，約5 min/次，加入稀釋好的二抗(1∶200)，濕盒中37℃孵育1.5 h(隨后操作全部在暗處進行)。用PBST浸泡并清洗3次，約5 min/次。滴加DAPI避光孵育5 min，使細胞核著色。隨后用PBST浸泡并清洗3～4次，5 min/次，洗去多余的DAPI，加入適量的PBS保持細胞濕潤，然后用高內涵細胞分析系統采集圖像，并進行熒光強度統計和分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 奧氮平對大鼠體重、攝食及肝腎重量的影響

與空白對照相比，奧氮平給藥組體重增加(P<0.05)，而對大鼠的攝食無影響(P>0.05)，故而推測奧氮平導致的大鼠體重增加是獨立于食物攝取的，即未影響能量攝入。肝臟及腎臟的重量變化差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.2 奧氮平對大鼠血脂的影響

與對照組相比，奧氮平給藥組大鼠血清TG、LDL和FFA的水平增加(P<0.05)，HDL的水平降低(P<0.05)，部分增加TC的水平，說明奧氮平具有導致大鼠血脂異常的風險。見圖4。

2.3 奧氮平對大鼠白色脂肪堆積及形態的影響

與對照組相比，奧氮平給藥組白色脂肪組織(WAT)重量及脂質比增加(P<0.05)，這是引起體重增加的主要因素。HE染色顯示，奧氮平給藥組脂滴的體積增大(P<0.05)，引起脂肪聚積，這是肥胖的典型標志。見圖5。

2.4 奧氮平對大鼠棕色脂肪產熱及形態的影響

與對照組相比，奧氮平給藥組在靜息狀態下肩胛處溫度下降(P<0.01)，表明在基礎條件下藥物使機體熱量產生減少，棕色脂肪的產熱活性降低，影響了能量輸出，這是機體能量消耗的另一部分；同時奧氮平降低了BAT的重量(P<0.01)；HE染色顯示，奧氮平組BAT的密度更小，中間有較大脂滴的形成，表明BAT形態發生顯著改變，這可能是棕色脂肪產熱活性的能力降低的原因。見圖6。

2.5 奧氮平對大鼠BAT中UCP1和PRDM16的影響

BAT蛋白檢測顯示，奧氮平下調了UCP1(P<0.001)和PRDM16(P<0.001)蛋白表達。同時β3-AR受體也被下調(P<0.05)，AMPK蛋白有下調的趨勢，但無統計學意義(P>0.05)。綜上說明奧氮平引起產熱降低主要是通過影響β3-AR激動的棕色脂肪的非顫栗性產熱所致。見圖7。

2.6 奧氮平對棕色脂肪細胞形成及UCP1蛋白的影響

選擇10 μM的奧氮平作用于棕色脂肪細胞的分化期，根據油紅染色發現，奧氮平顯著抑制了棕色脂肪細胞的分化(P<0.001)，甘油三酯相對含量分別為0.91±0.08和0.70±0.02；免疫熒光染色顯示，奧氮平下調了棕色脂肪細胞特異性標記蛋白UCP1的水平(P<0.05)，相對熒光強度分別為1.47±0.13和0.94±0.04。見圖8。

3 討論

精神分裂癥是一種嚴重慢性致殘性的精神疾病，患病率約為1%，是目前全球社會經濟負擔最重的疾病之一。藥物治療仍然是目前精神疾病治療的基石，但是長期慢性使用抗精神病藥易引發患者發生代謝綜合征(如糖尿病、肥胖、高血壓和高膽固醇血癥)的風險。而抗精神病藥影響能量代謝平衡導致代謝異常的機制尚不明確。本研究發現，奧氮平長期慢性給藥引起了大鼠過量脂肪堆積和體重增加，與既往的研究[12]一致。同時，奧氮平使大鼠血清中TG、LDL、HDL和FFA水平發生變化，引起機體血脂異常和游離脂肪酸增加，這也是代謝綜合征進展的關鍵組成部分。

除血脂代謝紊亂外，奧氮平打破機體的能量平衡，使機體患代謝疾病風險增加。越來越多研究[13]表明，代謝紊亂表型可能與棕色脂肪組織中的產熱活性降低有關。棕色脂肪作為一種具有產熱作用的內分泌器官，對肥胖治療有潛在的研究價值。棕色脂肪細胞具有相當數量的代謝活性，能夠以產熱的形式在成年人中分散能量。本研究表明，奧氮平顯著下調靜息狀態下大鼠的肩胛處溫度，限制了機體的能量消耗。HE染色也證明了奧氮平改變了棕色脂肪組織的形態，這可能解釋奧氮平產生過度鎮靜限制了棕色脂肪產熱活性。

研究[14]表明，PRDM16蛋白控制著骨骼成肌細胞和棕色脂肪細胞之間的雙向細胞命運開關。PRDM16蛋白在培養細胞或體內的白色脂肪前體中表達時，可以打開全部棕色脂肪選擇性基因，同時關閉幾個富含白色脂肪基因的表達[15]。本研究結果顯示，奧氮平顯著降低了棕色脂肪組織中β3-AR的表達，同時顯著下調了PRDM16和UCP1蛋白的含量，表明奧氮平給藥降低了棕色脂肪中β3-AR受體的活性，從而導致下游PRDM16和UCP1的含量減少導致產熱活性降低而介導了代謝綜合征的表型。

本研究參照Xue等[16]的方法通過C3H10T1/2細胞建立了棕色脂肪細胞模型，選用的奧氮平濃度10 μM作用于C3H10T1/2細胞分化期間，每2天更換誘導液，從細胞層面探索奧氮平對棕色脂肪細胞發育分化的作用。油紅染色和免疫熒光結果顯示，奧氮平不僅抑制了棕色脂肪細胞的分化，還了降低UCP1的表達量，進一步驗證了奧氮平降低了棕色脂肪細胞產熱活性從限制能量消耗引起體重增加和肥胖潛在機制。

綜上，奧氮平長期應用可能通過抑制β3-AR-AMPK-PRDM16-UCP1信號通路誘發SD大鼠棕色脂肪組織重量和形態改變，減少棕色脂肪的產熱活性和產熱蛋白UCP1的表達；同時抑制了棕色脂肪細胞的形成，促使棕色脂肪向白色脂肪轉化，導致機體代謝紊亂的表型，為臨床抗精神病藥引起的副作用干預，提高治療依從性提供了理論的新策略。