極化液對內毒素休克兔腦氧化損傷的影響

李洪瓊，王藝錚，萬勇，2

(川北醫學院，1.附屬醫院麻醉科；2.麻醉系，四川 南充 637000)

內毒素休克是嚴重循環、細胞和代謝失調的膿毒癥，死亡率高達35%～40%，而腦是早期受累的器官之一。目前，內毒素休克尚缺乏有效的治療手段，且因腦損傷，幸存者大多存在認知和行為功能異常，減輕腦損傷可改善預后，降低死亡率[1]。研究[2-3]證實，內毒素休克時內毒素、缺血缺氧等因素導致腦組織中過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、氧自由基(O-)等氧化物大量產生，而腦氧耗高，抗氧化能力弱，早期即可出現腦氧化損傷，進一步破壞血腦屏障，加重炎癥反應、細胞凋亡及免疫失衡等，氧化與抗氧化失衡是腦損傷的主要機制，早期干預可改善預后。研究[4-6]證實，葡萄糖-胰島素-鉀(極化液，GIK)對缺血心肌有保護作用，可減輕內毒素血癥大鼠肝臟、腸道、脾臟損傷，改善內毒素休克患者血流動力學，減輕內毒素血癥大鼠腦損傷，其機制包括清除氧化物、增加抗氧化劑的產生，減輕氧化損傷、減少細胞凋亡、減輕炎癥反應等，可用于治療腦缺血再灌注、內毒素血癥、危重癥等。本研究通過靜脈注射脂多糖建立內毒素休克兔模型，觀察GIK對內毒素休克兔腦損傷的影響,初步探索其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 普通級健康雄性新西蘭大白兔由川北醫學院動物實驗中心提供[許可證編碼：SYXK(川)2013-076]，體重2～3 kg，兔齡12～15周；實驗前適應性飼養1周。本實驗經川北醫學院倫理委員會審查批準，且實驗人員具備動物實驗從業資格證書。

1.1.2 主要儀器與試劑 監護儀MEC-2000(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)，三諾安穩血糖儀，分光光度計(美國分子儀器公司)，脂多糖LPS(Escherichia：coli055：B5，Sigma公司，美國)，氧化指標包括H2O2測定試劑盒(比色法A064-1-1)、NO測定試劑盒比色法(A012-1-2)、一氧化氮合成酶(NOS)分型測試盒(比色法，A014-1-2)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法，A003-1-2)和抗氧化指標包括總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1法，A001-3-2)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒微板法(A015-2-1)(南京建成生物工程研究所)，兔NSE ELISA試劑盒(上海滬尚生物科技有限公司)，透射電鏡H-600IV(Quantum Design中國子公司)，數碼三目攝像顯微鏡BA400Digital(麥克奧迪實業集團有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 內毒素休克模型建立與動物分組 稱量并記錄體重后經左耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)麻醉，隨后行耳緣靜脈、頸動脈穿刺置管，采用壓力傳感器連接監護儀監測血壓，兩組均1 min內經耳緣靜脈注射LPS 0.5 mg/kg，共計2.5 mL/kg，待平均動脈壓(MAP)下降至基礎血壓70%以下且穩定5 min以上判定為內毒素休克模型建立成功[7]。將建模成功大白兔隨機分為內毒素休克組(ES)和極化液組(GIK)，每組各10只。

1.2.2 給藥及動物處理 ES組和GIK組分別靜脈持續泵注復方氯化鈉注射液和極化液GIK(葡萄糖G:200 G/L；胰島素I:60 U/L；氯化鉀K:60 mmol/L)，5 mL·kg-1·h-1，時間6 h。靜脈注射空氣法處死白兔并立即采集腦組織標本。實驗中排除動脈置管過程中失血過多(超過10 mL)及給予LPS后2 h內MAP沒有下降至基礎MAP 70%以下(3只)或者快速下降基礎MAP 30%以下甚至實驗過程中死亡的白兔(2只)，共5只，并進行相應補充，保證每組10只存活至實驗結束。實驗過程中每隔2 h經靜脈注射1%戊巴比妥3 mL維持麻醉深度。

1.2.3 平均動脈壓和血糖監測 采用邁瑞監護儀和血糖儀監測記錄動靜脈操作完成后30 min(0T)、LPS注射后造模完成(T0)、復蘇后第1小時(T1)、第2小時(T2)、第3小時(T3)、第4小時(T4)、第5小時(T5)、第6小時(T6)的MAP、血糖(G)。

1.2.4 血清NSE濃度檢測 分別于0T、T0、T3、T6采集動脈血2 mL，加2 mL肝素生理鹽水，室溫靜置30 min后，3 500 rpm離心5 min，取上清液分裝，-80 ℃保存。采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測NSE濃度，操作按試劑盒說明書進行。

1.2.5 氧化和抗氧化指標水平檢測 實驗結束后立即取左腦皮質-80℃保存，室溫解凍后取適量皮層腦組織除去血管及腦膜，放置在冰0.9%氯化鈉注射液中漂洗，洗去血液等雜質后用濾紙吸干水分并準確測量0.5 g腦組織，置入預冷的0.45 mL冰0.9%氯化鈉注射液中作為勻漿介質(體積比為1∶9)，用無菌玻璃勻漿管冰水浴條件下手動勻漿數分鐘，待充分研磨后放置離心管中，用低溫高速離心機于4℃，3 000 rpm離心10 min，取上清液即為10%腦組織勻漿,將制備好的10%組織勻漿用生理鹽水按1∶4稀釋成2%組織勻漿，嚴格按照考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒說明書測定并計算腦組織勻漿中蛋白含量(mgprot/mL)，隨后嚴格按照試劑盒方法測定勻漿中H2O2、NO、iNOS、MDA、SOD、T-AOC含量。

1.2.6 病理形態觀察 取1 cm×1 cm×0.2 cm大小右腦皮層組織兩塊放置在4%多聚甲醛溶液中固定，經脫水機脫水，透明劑透明，浸蠟后石蠟包埋，蠟塊常規切片(3～5 μm)后HE染色，具體如下：蘇木精染色10～20 min→自來水沖洗1～3 min→鹽酸酒精分化5～10 s→自來水沖洗1～3 min→放入50 ℃的溫水中或弱堿性水溶液返藍，直到出現藍色為止→再次自來水沖洗1～3 min→85%的酒精3～5 min→伊紅染色3～5 min→水洗5 s→依次梯度酒精(80%、95%、100%、100%)脫水各1.5 min→二甲苯透明→二甲苯1-二甲苯2，20～30 min→中性樹膠封片。染色完成后在光學顯微鏡下進行圖像采集：采用數碼三目攝像顯微攝像系統對皮層腦組織染色切片進行圖像采集，每張切片先于40×鏡下觀察皮層腦組織大體形態，再隨機采集100×和400×圖片，重點觀察記錄400×鏡下皮層腦組織形態學改變，包括神經元數目及排列情況、神經元完整性、皮層透光度等。另取右腦頂葉皮質層，1 cm3大小，放置3%戊二醛中4℃冰箱保存，每組隨機選取3塊保存在3%戊二醛中的皮層腦組織，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，脫水劑濃度梯度為30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%(100%濃度脫水3次)，脫水后的腦皮質先后經過脫水劑和環氧樹脂滲透液滲透，兩試劑比例分別為3∶91；1∶91；1∶93，每步30～60 min。將滲透好的組織塊放到灌有包埋液的模具中包埋，經加溫聚合形成包埋塊。超博切片機切出50 nm左右的切片，依次醋酸鈾→檸檬酸鉛染色(染色時間：室溫下染色15～20 min)。10 000×和20 000×電鏡下隨機選取視野觀察并記錄皮層腦組織線粒體分布與結構改變情況。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 兩組大白兔MAP、G水平比較

注射LPS后，兩組大白兔MAP均降低(P<0.05)，但均高于T0(P<0.05)。復蘇治療后，兩組大白兔MAP逐漸回升，且GIK組MAP回升更明顯，在T1～T6各時間點均高于ES組(P<0.05)；兩組大白兔血糖均先升高后降低，且ES組T1時高于GIK組(P<0.05)，T4、T5、T6時低于GIK組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大白兔MAP、G水平比較

2.2 兩組大白兔血清NSE濃度比較

與基礎值0T相比，注射LPS后ES組和GIK組血清中NSE水平均隨時間持續升高，且均高于0T(P<0.05)；T3、T6時，GIK組低于ES組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組大白兔血清NSE濃度比較

2.3 兩組大白兔氧化及抗氧化指標比較

ES組氧化物NO、H2O2、MDA含量及iNOS活力高于GIK組(P<0.05)，抗氧化指標SOD活力和T-AOC值低于GIK組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組大白兔氧化及抗氧化指標比較

2.4 兩組大白兔病理結果比較

光鏡下觀察顯示，ES組皮層腦組織細胞層排列紊亂，皮質透光度增強，血管間隙增大，神經元細胞明顯腫脹，偶見神經細胞壞死、膠質細胞吞噬壞死神經元細胞的衛星現象。GIK組皮層腦組織細胞層排列紊亂，皮質透光度增強，血管擴張，血管間隙增寬，細胞形態未見明異常，偶有神經細胞輕度水腫、壞死。以上結果表明兩組均存在明顯腦損傷，GIK組干預后腦損傷減輕。電鏡可見ES組部分線粒體明顯腫脹，基質顆粒丟失嚴重，線粒體脊消失，電子密度不均勻。GIK組線粒體分布正常，線粒體脊可見，電子密度基本均勻，部分線粒體輕度腫脹、基質粒丟失。以上結果顯示內毒素休克兔腦組織線粒體損傷明顯，GIK組損傷輕于ES組。見圖1及圖2。

3 討論

內毒素休克主要表現為嚴重低血壓、微循環障礙和多器官功能障礙，早期即可發生腦損傷，使死亡率增高，目前仍缺乏有效的治療手段，糾正低血壓、減輕氧化與抗氧化失衡可明顯減輕腦損傷。GIK由葡萄糖、胰島素和鉀組成，其中胰島素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，葡萄糖抵抗低血糖，胰島素和葡萄糖共同協助鉀從細胞外液向細胞內液的轉運，三種成分共同發揮生物活性且無低血糖、低鉀副作用，可改善膿毒癥患者心肌損傷及血流動力學，減輕內毒素血癥大鼠腸道、肝臟、脾臟損傷。本研究發現，GIK干預治療6 h內MAP水平高于ES組，且從治療第2小時開始，GIK組MAP值穩定在70 mmHg以上，表明GIK干預可明顯改善內毒素休克兔血流動力學。本小組前期研究也觀察到大鼠腹腔注射LPS后2 h血糖升高，隨后血糖降低甚至發生低血糖。循證醫學證據顯示，血糖過高或過低均可導致內毒素休克患者死亡率增加，維持血糖穩定接近正常水平或許使得患者利益最大化[8]。而合適配比的GIK可避免胰島素治療后低血糖副作用的同時不影響胰島素生物學效應。本實驗中GIK組血糖水平更穩定且接近正常水平(3.9～6.1 mmol/L)，證實配比的GIK成分合理。

大量研究[1-3]證實，內毒素休克早期腦組織(尤其是皮層區和海馬區)H2O2、O2-、NO、NOS合酶及ONOO-等被激活，氧化物大量堆積，SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽酶等抗氧化酶無法及時清除，氧化與抗氧化失衡發生腦損傷。MDA是氧化損傷后脂質過氧化損傷的重要標記物，與氧化損傷程度正相關；NSE作為腦損傷的特異性標志物，與腦損傷程度呈正比，T-AOC可客觀評價整體抗氧化水平。本實驗觀察到靜脈注射LPS后腦組織中氧化物NO、NOS、H2O2而SOD活性、T-AOC值降低，NSE、MDA水平增高，組織學上腦神經元破壞明顯，證實內毒素休克兔早期發生腦損傷，且存在氧化與抗氧化失衡。基于胰島素有抗氧化作用，解剖上腦實質及血腦屏障上廣泛分布GLUT和胰島素受體，葡萄糖作為腦的主要能源，可通過血腦屏障上GLUT轉運入腦實質，改善腦能量代謝，減輕腦損傷，葡萄糖和鉀鹽可協同增強胰島素的效能[9]。因此，采用GIK治療內毒素休克兔，發現治療6 h后腦神經元破壞減少，血清NSE和腦氧化物水平顯著降低，SOD和T-AOC明顯升高，表明GIK明顯減輕腦損傷，降低氧化物水平，增強抗氧化能力，與Muller等[10]的實驗結果相符。另外，考慮到線粒體作為氧化物產生重要場所也是腦氧化損傷關鍵靶點[11]，線粒體損傷可進一步佐證氧化損傷程度，設計電鏡下觀察腦線粒體超微結構變化，證實ES組線粒體結構破壞明顯，而GIK組明顯減輕，進一步證實GIK可減輕內毒素休克兔腦損傷。但由于實驗條件限制，本實驗未能在GIK減輕線粒體氧化損傷的具體機制方面作進一步研究。

綜上，GIK(G:200 g/L，I：60 IU/L，KCL:60 mmol/L)可減輕LPS誘導內毒素休克兔腦損傷，其可能機制為：(1)GIK可改善內毒素休克兔血流動力學；(2)GIK降低腦氧化物水平，減輕內毒素休克兔腦氧化損傷。