不同方法提取川芎揮發油化學成分及抗氧化活性的比較

夏珊，李生茂，張馨予，魯琴芮，李倩茹，敖慧

(1.川北醫學院藥學院·川北醫學院藥物研究所，四川 南充 637000；2.成都中醫藥大學，四川 成都 611137)

川芎為傘形科植物川芎的干燥根莖，有活血行氣、祛風止痛的功效[1]。研究[2-6]發現，揮發油是川芎的主要藥效物質基礎之一，主要含有以藁本內酯等為代表的苯酞類、烯萜醇類及脂肪酸類等成分，有鎮靜、解熱、鎮痛、改善血液流變、抗氧化、降血壓、抗抑郁及抗缺血再灌注損傷等藥理活性，其中抗氧化是對抗腦缺血再灌注損傷的藥理作用機制之一[7-9]。目前，對川芎揮發油提取方法的研究主要有超臨界流體萃取法、水蒸氣蒸餾法、石油醚提取法、中性乙醇提取法、蒸餾-萃取耦合法和提取-共沸精餾耦合法等[10-11]，但多集中于比較不同方法提取的川芎揮發油的化學成分差異，而對提取成分抗氧化活性差異的研究較少。本研究旨在比較水蒸氣蒸餾法(steam distillation，SD)、以石油醚為溶劑的索氏提取法(soxhlet extraction，SE)和超臨界CO2萃取法(supercritical CO2extraction，SFE-CO2)提取的川芎揮發油的化學成分及抗氧化活性的差異，為進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

川芎藥材購于成都五塊石中藥材批發市場，并經川北醫學院李毅主任中藥師鑒定為傘形科植物川芎(Ligusticum Chuanxiong)的干燥根莖。1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylphenylhydrazine，DPPH，美國sigma公司)、正己烷(國藥集團化學試劑有限公司)、無水硫酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)、甲醇(成都市科龍化工試劑廠)和石油醚(成都市科龍化工試劑廠)均為分析純。Ohaus Discovery 1/100 000電子分析天平購于奧豪斯儀器(上海)有限公司，Epoch 微孔板分光光度計購于美國BIOTEK 公司，Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀購于美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 川芎揮發油的提取 取川芎粗粉過20目篩后提取。(1)SD[12]：取約200 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，加入1 200 mL蒸餾水，按《中國藥典》2015年版一部揮發油測定法(附錄XD甲法)進行，水蒸氣蒸餾5 h，收集揮發油。(2)SE[13]：取約20 g，置于索氏提取器，加入200 mL石油醚(60～90℃)，提取3 h，濾過，濾液減壓濃縮，收集揮發油。(3)SFE-CO2[14]：取約30 g，于萃取斧溫度44℃、壓力4 000 PSI下萃取1 h，收集揮發油。

1.2.2 川芎揮發油化學成分及相對含量測定 取提取的川芎揮發油樣品，加正己烷稀釋，用無水硫酸鈉除去水分，0.22 μm微孔濾膜過濾；氣相色譜-質譜法(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS)分析測定(GC條件：載氣為氦氣；體積流量1.0 mL/min；程序升溫，初始溫度50℃，保持2 min；10℃/min速率升至120℃，保持8 min；5℃/min速率升至180 ℃，保持8 min；20℃/min速率升至260℃，保持4 min，分流進樣，分流比：分流比1∶60；進樣量1 μL；進樣口溫度280℃)川芎揮發油的總離子流圖，通過工作站 NIST 標準質譜圖庫檢索并結合文獻報道[15-17]，確定各色譜峰代表的化學成分，并按面積歸一化法計算各成分在揮發油中的相對含量。

1.2.3 川芎揮發油抗氧化活性檢測 通過測定川芎揮發油對DPPH自由基的清除率檢測其抗氧化活性[18-19]：稱取適量DPPH加甲醇配制成170 μmol/L的溶液，避光保存。取川芎揮發油樣品適量，加甲醇溶解并稀釋成一定濃度的供試品溶液，并取0.15 mL與0.15 mL DPPH溶液置96孔板，混勻后室溫避光放置60 min，517 nm處測定吸收度A1；同時測定0.15 mL供試品溶液+0.15 mL甲醇的吸收度A0，0.15 mL甲醇+0.15 mL DPPH溶液的吸收度A2。DPPH自由基清除率=[1-(A1-A0)/A2]×100%。以清除率(Y)對藥物濃度(x)進行回歸，根據對數函數方程求出清除率為50%時藥物的濃度(IC50)。

1.3 數據分析

2 結果

2.1 川芎揮發油的化學成分

SD提取的川芎揮發油，檢測到44個色譜峰，鑒定其中32個色譜峰的峰面積之和占總峰面積的93.74%。其中，Z-藁本內酯相對含量最高，占53.71%，其次是川芎內酯(13.94%)、丁基苯酞內酯(6.77%)、丁基苯酞(3.58%)和β-Selinene(2.97%)。在鑒定的化合物類型中，內酯類(苯酞類)5個，峰面積之和占總峰面積的79.13%；烯類12個，占6.54%；酮類1個，占0.90%；醇類6個，占4.10%；酚類3個，占1.92%；脂肪酸及其酯類1個，占0.10%；其他類4個，占1.05%。SE提取的川芎揮發油檢測到23個色譜峰，鑒定其中18個色譜峰的峰面積之和占總峰面積的96.61%。其中，Z-藁本內酯相對含量最高，占43.43%，其次是川芎內酯(22.39%)、亞油酸(15.74%)、丁基苯酞內酯(3.38%)、丁基苯酞(2.88%)。在鑒定的化合物類型中，內酯類(苯酞類)6個，占74.08%；烯類5個，占3.56%；酚類1個，占0.68%；醇類2個，占0.59%；脂肪酸及其酯類2個，占16.13%；酰胺類1個，占1.42%；酮類1個，占0.15%。SFE-CO2提取的川芎揮發油檢測到30個色譜峰，鑒定其中21個色譜峰的峰面積之和占總峰面積的94.44%。其中，Z-藁本內酯相對含量最高，占46.93%，其次是川芎內酯(23.40%)、亞油酸(6.93%)、丁基苯酞內酯(4.49%)、丁基苯酞(4.10%)。在鑒定的化合物類型中，內酯類(苯酞類)5個，占80.13%；烯類7個，占4.32%；醇類2個，占0.69%；酚類1個，占0.25%；脂肪酸及其酯類6個，占9.05%。SD、SE及SFE-CO2提取的川芎揮發油有10個共有成分，分別為4-萜烯醇、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、β-Selinene、Espatulenol、丁基苯酞、丁基苯酞內酯、川芎內酯、Z-藁本內酯、E-藁本內酯和亞油酸甲酯，其中Z-藁本內酯含量最高，分別為53.71%、43.43%和46.93%；10個共有成分相對含量之和分別為87.17%、76.58%和83.40%，且均以苯酞類為主，相對含量分別為79.13%、74.08%和80.13%。見表1、圖1及圖2。

表1 三種方法提取的川芎揮發油成分

2.2 川芎揮發油的PCA

表2 PCA特征值及累積方差貢獻率

2.3 川芎揮發油的抗氧化活性

SD、SE及SFE-CO2提取的川芎揮發油對 DPPH自由基均有一定的清除作用，且清除率與劑量有依賴關系。對數回歸方程分別為YSD=0.2495ln(x)+0.9001，R2=0.9243、YSE=0.3186ln(x)+0.7772，R2=0.9962、YSFE-CO2=0.2585ln(x)+0.519，R2=0.9779；IC50值分別為0.20 mg/mL、0.42 mg/mL、0.93 mg/mL；三種方法提取川芎揮發油清除DPPH自由基的能力大小依次為SD>SE>SFE-CO2。見圖4。

3 討論

SD利用揮發油難溶于水且沸點較低，可隨水蒸氣蒸出來的原理提取，具有設備簡單、容易操作、成本較低等優點，是提取揮發油的經典方法之一，但易破壞熱敏性成分，且能耗較大。SE利用揮發油易溶于石油醚、乙醇、正己烷、乙醚、丙酮等有機溶劑的原理，通過有機溶劑減壓濃縮回收得到揮發油成分，耗能小、工藝簡單，且揮發油得率相對較高，但所得揮發油多含有植物蠟、色素、脂肪等雜質，并存在提取時間長、溶劑使用量大、回收困難等不足。SFE-CO2是最近三十多年快速發展起來的一種提取揮發油的方法，具有提取溫度低、效率高、不破壞熱敏成分及無溶劑殘留等優勢，但所需設備價格貴、運行成本高[22-24]。

本研究采用GC-MS分析比較SD、SE和SFE-CO2提取的川芎揮發油，結果顯示，SD提取的川芎揮發油中化學成分數量相對最多，為44個，SFE-CO2次之，為30個，SE相對最少，為23個。在鑒定的化學成分中，三種方法提取的川芎揮發油有10個共有成分，共有成分相對含量之和分別達87.17%(SD)、76.58%(SE)和83.40%(SFE-CO2)，且均以苯酞類化學成分為主，相對含量分別為79.13%、74.08%和80.13%，表明這三種方法提取的川芎揮發油主要化學成分相似，僅相對含量有所不相同。除共有成分外，不同方法提取的揮發油的化學成分種類也有一些差異。其中，SD提取的川芎揮發油烯類成分較多，如α-蒎烯、萜品油烯、γ-萜品烯、5-Pentylcyclohexa-1,3-diene、α-松油醇、β-Elemene、Tetradecamethylcycloheptasiloxane、β-Cadinene、Neoisolongifolene、γ-Selinene、1-isopropyl-7-methyl-4-methylene-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphthalene、15-Copaenol、(-)-藍桉醇和角鯊烯等。而SE及SFE-CO2提取的揮發油中亞油酸等脂肪酸類較多，與文獻報道[12,15-17]基本一致。

PCA結果顯示，SE和SFE-CO2提取川芎揮發油化學成分較為相似，與SD差異相對較大。三種方法提取的川芎揮發油均具有一定的抗氧化活性，其清除DPPH自由基活性的大小順序依次為SD>SE> SFE-CO2，可能與SD提取的川芎揮發油中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、α-蒎烯[25]、α-松油醇、γ-萜品烯[26]和角鯊烯[19]等具有較強清除DPPH自由基活性的成分有關。但川芎揮發油抗氧化的活性成分還有待進一步研究。

綜上所述，SD、SE和SFE-CO2提取的川芎揮發油化學成分的種類、數量和抗氧化活性存在一定差異，但主要化學成分相似，僅相對含量有所不同。