hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281在原發性痛風中的變化及臨床意義

戴菲，何怡曦，唐乙萍，董曾榮，周聞君，張全波，青玉鳳

(川北醫學院附屬醫院，1.高尿酸血癥與痛風研究中心；2.風濕免疫科；3.老年科，四川 南充 637000)

痛風是機體嘌呤代謝障礙引起組織損傷的一組臨床綜合征，主要表現有高尿酸血癥、關節炎、痛風石、關節畸形、泌尿系結石及腎臟實質性病變等[1]。流行病學研究[2]顯示，痛風患病率逐年上升，因評估方法不同，全球各地患病率1%～6.8%。目前痛風的具體發病機制尚不清楚。研究[1-4]發現，遺傳、免疫、環境因素以及飲食習慣等不同程度參與了痛風的發生發展。血清尿酸(serum uric acid,sUA)水平升高被認為是痛風發生的重要危險因素，研究[5]提示只有約10%的高尿酸血癥患者最終發展為痛風。同時，痛風患者容易并發糖尿病、高血壓、高血脂、心腦血管等疾病，對人體健康造成嚴重威脅。因此，闡明痛風的確切發病機理及找尋原發性痛風的早期診斷生物標記物，為早期診斷及治療痛風提供有力的證據尤為重要。

環狀RNA(circular RNA,circRNA)是區別于傳統線性RNA的一類新型非編碼RNA，具有閉合環狀結構，廣泛且多樣地存在于真核細胞中[6]。在腫瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病等發生發展中起著重要作用[7-9]，但在痛風中鮮有相關報道。為此，我們前期收集痛風患者及健康對照者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)行circRNA微陣列表達譜檢測，發現痛風中有多個異常表達的circRNA[10]。本研究選取其中在急性痛風患者中顯著高表達的hsa_circRNA_104633和顯著低表達的hsa_circRNA_406281兩個基因，擴大樣本量進行實時熒光定量多聚合酶鏈反應(quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)實驗，檢測其在大樣本不同分期痛風患者中的表達情況，初步探討hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281在原發性痛風中的差異表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年4月至2021年3月川北醫學院附屬醫院風濕免疫科就診的90例男性痛風患者作為研究對象，其中急性期痛風(active gout，AG)和間歇期痛風(inactive gout，IG)患者各45例，平均年齡分別為(42.00±13.50)歲和(43.00±20.00)歲，所有痛風患者均符合2015年ACR/EULAR制定的痛風診斷標準[11]，且排除腎臟原發疾病、腫瘤、藥物等所致繼發性痛風者。此外，AG患者出現關節腫脹、發熱、疼痛等癥狀不超過1周；IG患者至少有兩周沒有關節癥狀，并且炎癥指標，如紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、白細胞計數(white blood cell count，WBC)等在正常范圍內。另選擇同期到川北醫學院附屬醫院體檢中心進行體檢的健康男性60例作為對照組(healthy controls,HC)，平均年齡為(43.50±17.75)歲，其實驗室指標均在正常范圍，且無痛風病史及其他自身免疫性疾病、代謝性疾病等病史。三組研究對象年齡差異無統計學意義(P>0.05)。該研究獲得了川北醫學院附屬醫院倫理委員會批準，且所有參與者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 實驗室常規指標的收集 采集所有研究對象清晨空腹外周靜脈血4 mL,于LH750血細胞分析儀及DxC800全自動生化儀(美國Beckman公司)檢測sUA、空腹血糖(fasting blood glucose，GLU)、炎癥及脂質代謝指標水平。其中炎癥指標包括ESR，CRP，WBC，中性粒細胞粒計數(neutrophil granule count，GR)，淋巴細胞計數(lymphocyte count，LY)，單核細胞計數(monocyte count，Mo)；脂質代謝指標包括血漿總膽固醇(plasma total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglycerides，TG)，高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)，低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)，極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)。上述所有指標為受試者就診時的常規檢查，且均在川北醫學院附屬醫院臨床檢驗科進行。

1.2.2 hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281檢測 采用qRT-PCR法：收集所有研究對象肝素鈉抗凝的外周靜脈血2～3 mL，淋巴細胞分離液分離出PMBCs，根據Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書提取總RNA。采用紫外分光光度儀測定總RNA濃度及純度，選取吸光度值(A)260/280為1.8～2.0的標本，并以1‰DEPC水調整總RNA濃度至300 ng/mL。根據逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書，取2μL總RNA逆轉錄成cDNA。然后在LightCycle?96PCR儀(瑞士Roche公司)上進行PCR反應，反應總體積為10 μL。包括5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix，3.6ul ddH20，上下游引物各0.2 μL，1μL cDNA。以兩步法擴增，第一步：95℃ 30 s 1個循環→[95℃ 5 s→60℃ 34 s]40個循環。第二步：95℃ 15 s→60 60 s→95℃ 15 s 1個循環。本研究以β-actin作為內參基因，所有PCR引物均由上海生工生物工程有限公司合成，β-actin上游引物序列：5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，下游引物序列：5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3′，擴增片段大小120bp；hsa_circRNA_104633上游引物序列：5′-AGTAACTGCTCCCCCTGAGGA-3′,下游引物序列：5′-GGGACTGCTGGCTCTGAAGT-3′，擴增片段大小180bp；hsa_circRNA_406281上游引物序列：5′-ACTGATGATGGAGGCTTCAGTGA-3′，下游引物序列：5′-TCTGCTTGGACACTGAAGGTTGA-3′，擴增片段大小170bp。每份標本均設2個復孔，反應結束后作溶解曲線。以2-△C(t)作為circRNA的相對表達水平來分析不同樣本間circRNA的差異表達。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 三組研究對象臨床特點及主要實驗室指標比較

三組對象年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。痛風組(AG+IG)的炎癥指標如CRP、ESR、WBC、GR以及代謝指標如sUA、GLU、部分血脂相關指標等高于HC組(P<0.05)。AG組CRP、ESR、WBC、GR、Mo高于IG組(P<0.05)，兩組代謝指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)。此外，在IG組中，雖然所有炎癥指標均在正常范圍，但在正常范圍內的WBC、GR、Mo數值均較正常HC組高(P<0.05)。見表1。

表1 三組研究對象的臨床特點及實驗室指標比較

2.2 三組研究對象hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281的表達水平比較

hsa_circRNA_104633在AG及IG組中的表達均高于HC組(P<0.005)，但AG與IG組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；hsa_circRNA_406281在AG組中的表達高于IG及HC組(P<0.05)，但IG與HC比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.3 通風患者hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281基因表達水平與實驗室指標的關系

相關系分析顯示，hsa_circRNA_104633與sUA成正相關(r=0.305，P=0.003)，hsa_circRNA_406281與CRP、sUA呈負相關(CRP：r=-0.513，P<0.001；sUA：r=-0.213，P=0.043)。見表2。

表2 痛風患者hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281的表達水平與實驗室指標的相關性

2.4 hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281對痛風的診斷價值

ROC曲線顯示，hsa_circRNA_104633診斷痛風的AUC為0.822(95%CI：0.756～0.888；P<0.001；敏感性=76.70%；特異性=78.30%)，與hsa_circRNA_406281比較，差異無統計學意義(P>0.05)。考慮hsa_circRNA_406281在AG組的表達高于IG與HC組，推測其可能參與了急性痛風的炎癥反應，成為痛風潛在的炎癥標志物，故對其進行ROC曲線分析發現其AUC值為0.667(95%CI：0.576-0.759；P=0.001；敏感性為51.90%；特異性為84.10%)。見圖2。

3 討論

CircRNA可以充當miRNA海綿，影響蛋白質翻譯，或與RNA結合蛋白相互作用，調節蛋白質的募集與組裝[6]。因此，circRNA的多功能性使其成為研究和預測疾病的理想之選。近年來，越來越多的研究表明，circRNA的失調與多種風濕病的發生發展密切相關，如系統性紅斑狼瘡[12]、類風濕關節炎[13]、骨關節炎等[14]，但在痛風中鮮有相關報道。本課題組前期通過circRNA微陣列芯片篩選出與健康體檢者明顯差異表達的兩個circRNA分子hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281，通過查閱文獻，目前已有研究發現hsa_circRNA_104633可以被高遷移率族蛋白2調節，從而影響肺腺癌生長[15]。此外，關于hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281在胃癌、神經母細胞瘤、食管癌、肝臟寄生蟲等[16-19]相關疾病的微陣列芯片檢測中均有相關報道其差異表達，推測其可能參與了多種疾病的發生發展。本研究擴大樣本并通過PCR檢測了它們在痛風人群及HC中的相對表達量，發現hsa_circRNA_104633在痛風患者PBMCs的表達顯著增高，而hsa_circRNA_406281則顯著降低，提示兩個circRNA可能在痛風的發病機制中發揮作用。

痛風是一種炎癥性疾病，其急性炎癥反復發作且可自發緩解的機制是當今痛風炎癥機制研究中的熱點問題[20]。本研究發現即使間歇期痛風患者炎癥指標處于正常范圍，但其炎癥指標水平仍高于HC組，間接說明了即使在在痛風穩定期，痛風患者體內仍然存在低水平的炎性活動。此外，痛風也是一種代謝性疾病，流行病學調查顯示，痛風與高尿酸血癥，高脂血癥，高血糖等密切相關[3]，sUA水平升高被認為是痛風發生的重要危險因素[1,5]，高尿酸血癥是高血壓病、冠心病、糖尿病等代謝性疾病的獨立危險因素之一。研究發現[1,21-23]尿酸代謝紊亂與脂代謝或者糖代謝可能互為因果，一方面脂肪代謝產生的酮體可阻礙sUA排泄，間接使sUA水平增高，而sUA水平升高可降低脂蛋白酶活性，影響脂質代謝。另一方面，sUA持續升高可損害胰腺B細胞功能，出現胰島素抵抗，而持續的高血糖狀態可使機體出現氧化應激，損傷血管內皮，促使血管平滑肌細胞增殖，可引起腎小球動脈硬化，腎血流量減少，上述過程可導致sUA排泄障礙，使sUA水平增高。而circRNA作為非編碼RNA的一種，在調節免疫炎癥反應及代謝性疾病中發揮著重要作用：如近期發現，肝臟成纖維細胞中脂質暴露引發的內質網應激導致線粒體中circRNA SCAR表達量下降，原本與其結合的ATP合成酶β5轉而與親環素D蛋白結合，導致線粒體通透性轉換孔通道開放，使線粒體中的活性氧自由基釋放到胞質中，加重非酒精性脂肪性肝炎[24]；另有研究表明circHIPK3可競爭性結合miR-192-5p從而上調轉錄因子FOXO1導致高血糖和胰島素抵抗[25]；Circ_0001103可調控miR-375以及去乙酰化酶1來改善炎癥因子IL-1 β誘導的軟骨細胞損傷[26]。本研究從炎癥、尿酸代謝、脂代謝、糖代謝方面選擇上述實驗室指標與兩個circRNA分子在痛風患者中的相對表達量進行了相關性分析。結果發現hsa_circRNA_104633與sUA成正相關，hsa_circRNA_406281與CRP、sUA呈負相關，提示hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281可能參與痛風患者的尿酸代謝調節，且hsa_circRNA_406281還可能參與了痛風炎癥調節，其具體機制有待進一步研究。

隨著人們生活水平的提高，痛風已是我們生活中的常見病、多發病。大部分AG患者伴有高尿酸血癥，但仍有部分痛風患者sUA水平在正常范圍，一項關于221名AG患者的回顧性隊列研究中發現約40%的痛風患者急性期無sUA水平的升高[27]。目前在偏振光顯微鏡下發現MSU晶體仍是診斷痛風的金標準，但是，作為一項有創操作，臨床應用很少，特別是對于沒有高尿酸血癥的痛風患者，MSU的檢出率非常低，因此尋找有效的痛風診斷標志物及治療靶標至關重要。CircRNA具有獨特的結構，高穩定性和特定的表達方式，近年來，越來越多的證據表明circRNA可以作為多種疾病的新型診斷標志物，如組織樣品中circ-PSD3可能是甲狀腺乳頭狀癌的潛在診斷生物標志物[28]；circFKBP8和circMBNL1在外周血中異常表達可能是診斷重度抑郁癥的生物標志物[29]；全血中hsa_circ_0082688和hsa_circ_0082689可作為系統性紅斑狼瘡的診斷生物標記[12]。然而，目前沒有關于使用circRNA作為痛風的生物標志物的報道。體液是診斷多種人類疾病的常用材料，尤其是外周血在診療疾病方面具有獨特的優勢。由于保守的共價閉合的環狀結構，circRNA對RNA酶具有較高的抵抗性，使其在體液或外周血中得以富集[6]。在本研究中，痛風組PBMCs中hsa_circRNA_104633的表達水平顯著高于HC組。通過ROC曲線進一步分析了它們的診斷價值顯示hsa_circRNA_104633的曲線下面積大于0.8，可以很好的將痛風患者和健康人群區分開。這表明hsa_circRNA_104633可能具有作為痛風生物標志物的潛力。但是，需要更大的樣本量及不同人群的比較進一步證實我們的結果。

綜上，本研究發現hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281在痛風患者PBMCs中異常表達，提示其可能參與痛風發病，進一步分析發現hsa_circRNA_104633的表達量與痛風患者血尿酸濃度呈正相關，而hsa_circRNA_406281則與血尿酸濃度呈負相關，提示這兩個circRNAs可能參與痛風患者尿酸代謝的調節；同時發現hsa_circRNA_406281的表達量與CRP呈負相關，提示hsa_circRNA_406281可能還與痛風炎癥調節密切相關。此外，hsa_circRNA_104633能很好的將痛風患者與HC區分開，在痛風臨床診斷和治療中可能具有潛在的用途。但是本研究也存在一些局限性，未來的研究將通過擴大樣本量、設置疾病組對照、進行功能實驗等來進一步明確它們在痛風中的分子機制和特定功能。