丙泊酚對(duì)大鼠腸缺血-再灌注炎癥反應(yīng)的影響

陳思言，歐剛，陳斌

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 南充 637000)

腹部外傷、失血性休克、嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、燒傷可發(fā)生腸缺血-再灌注(ischemia reperfusion injury，IRI)損傷[1]。腸IRI不僅可以引起腸道組織局部損害，還可以導(dǎo)致細(xì)菌和毒素移位到體循環(huán)，產(chǎn)生異常的組織反應(yīng)，促炎癥細(xì)胞因子大量釋放入血，引發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征，后期可發(fā)展為多器官功能衰竭[2]。因此，目前缺血-再灌注損傷的機(jī)制，以及如何減輕IRI產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷一直是研究熱點(diǎn)。在腸缺血-再灌注損傷中炎癥細(xì)胞因子發(fā)揮了重要作用，在腸道組織發(fā)生缺血再灌注后，細(xì)胞會(huì)釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)及IL-6等炎癥細(xì)胞因子，對(duì)受損的細(xì)胞組織產(chǎn)生損傷。IL-1和IL-6都具有多種致炎活性，包括白細(xì)胞趨化、吞噬細(xì)胞刺激、增強(qiáng)下游細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。TNF-α可提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力，也能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)IL-1、IL-6的分泌，并能促進(jìn)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，從而刺激擴(kuò)大機(jī)體局部炎癥反應(yīng)及組織的損傷[3]。因此，炎性因子在缺血-再灌注過(guò)程中的表達(dá)水平來(lái)反映炎癥反應(yīng)的強(qiáng)烈程度，同時(shí)也反映出缺血-再灌注損傷的嚴(yán)重程度。丙泊酚具有麻醉誘導(dǎo)快和恢復(fù)迅速的特點(diǎn)，是外科手術(shù)麻醉的基本藥物。丙泊酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)與天然抗氧化劑維生素E的結(jié)構(gòu)類似，能抑制氧自由基的產(chǎn)生或拮抗其氧化效應(yīng)，對(duì)缺血-再灌注損傷有預(yù)防或治療作用[4]，但丙泊酚對(duì)腸缺血-再灌注的炎癥反應(yīng)有何影響，尚未見臨床報(bào)道。本研究擬構(gòu)建大鼠腸缺血-再灌注損傷模型，使用丙泊酚預(yù)處理，觀察對(duì)腸組織病理形態(tài)學(xué)改變，Chiu氏評(píng)分[5]及對(duì)IL-1、IL-6、TNF-α含量的影響，探討丙泊酚是否對(duì)大鼠腸缺血-再灌注損傷有預(yù)防或治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康雄性SPF級(jí)SD大鼠40只，體重(220±30)g，購(gòu)于川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。術(shù)前禁食12 h，自由飲水。本研究已通過(guò)川北醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審查，批號(hào)為NSMC倫理動(dòng)物審[2021]01號(hào)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型創(chuàng)建 參考Wang等[6]的實(shí)驗(yàn)方法建立腸IRI模型。術(shù)前大鼠禁食12 h，自由飲水，給予3%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，待麻醉生效后，將大鼠仰臥位固定于解剖板上，常規(guī)手術(shù)區(qū)域消毒鋪巾，取腹正中切口2.0～3.0 cm，用37℃左右無(wú)菌生理鹽水紗布保護(hù)切口，分離腸系膜動(dòng)脈，以無(wú)創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉腸系膜動(dòng)脈(SMA)根部，可見腸系膜動(dòng)脈搏動(dòng)消失，結(jié)腸組織顏色由鮮紅變蒼白，表明SMA成功阻斷，縫合切口，1h后原切口進(jìn)腹，移走動(dòng)脈夾，恢復(fù)血流實(shí)施再灌注，肉眼可見腸系膜動(dòng)脈搏動(dòng)恢復(fù)，結(jié)腸組織顏色由暗紅變?yōu)轷r紅。術(shù)中用白熾燈加熱保溫，維持直腸溫度36～38℃，每隔30 min觀察大鼠結(jié)腸組織血供情況。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、腸I/R損傷(I/R組)、丙泊酚預(yù)處理組(P組)和NS預(yù)處理組(NS組)，每組各10只。S組和I/R組實(shí)驗(yàn)開始前連續(xù)3 d腹腔既不注射丙泊酚也不注射生理鹽水，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，S組僅分離腸系膜上動(dòng)脈而不夾閉，I/R組分離腸系膜上動(dòng)脈后夾閉1 h，再灌注2 h；P組于實(shí)驗(yàn)前每天18∶00點(diǎn)腹腔注射丙泊酚50 mg/kg，連續(xù)3 d；實(shí)驗(yàn)開始時(shí)分離腸系膜上動(dòng)脈夾閉1 h，再灌注2 h；NS組于實(shí)驗(yàn)前同一時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等容積0.9%生理鹽水，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)操作同P組。

1.2.3 標(biāo)本處理 恢復(fù)正常血液灌注2 h時(shí)處死大鼠，打開腹腔，迅速取出升結(jié)腸組織，用裝有4℃生理鹽水的注射器沖洗腸道內(nèi)容物，然后縱向剖開腸道，濾紙吸干水分，切3 mm組織進(jìn)行組織學(xué)分析，把腸道卷成瑞士卷樣，然后放入活檢盒中維持瑞士卷狀浸泡入多聚甲醛，其余部分置于-196℃液氮中保存，檢測(cè)IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平。

1.2.4 結(jié)腸黏膜形態(tài)學(xué)觀察和病理學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸組織用多聚甲醛溶液固定24 h，而后經(jīng)乙醇梯度脫水(70%、80%、90%、95%、100%)，二甲苯透明，石蠟包埋，做成蠟塊，用石蠟切片機(jī)將包埋好的蠟塊切成厚度5 μm連續(xù)切片，烤片后進(jìn)行蘇木素/伊紅染色，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變情況。每個(gè)標(biāo)本取2個(gè)不同切片，每個(gè)切片取10個(gè)視野取均數(shù)(100×)。采用Chiu氏評(píng)分法[5]評(píng)價(jià)腸黏膜損傷程度，0分為正常絨毛；1分為絨毛頂端黏膜下出現(xiàn)間隙，毛細(xì)血管充血；2分為黏膜下間隙擴(kuò)大，腸黏膜與黏膜下層分離；3分為黏膜與黏膜下層分離延伸到腸絨毛兩側(cè)；4分為絨毛變鈍，固有層及其血管暴露，炎性組織浸潤(rùn)；5分為固有層消化崩解，出血或形成潰瘍；分值越高表示組織病變?cè)絿?yán)重。

1.2.5 炎性細(xì)胞因子檢測(cè) 取約100 mg結(jié)腸組織，加入0.9 mL生理鹽水制成10%的組織勻漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)按試劑盒(江蘇酶聯(lián)生物科技提供)說(shuō)明書，檢測(cè)結(jié)腸組織中TNF-α，IL-1、IL-6含量。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被抗體的微孔中依次加入抗原、生物素化的抗大鼠抗體、親和素過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC)，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色液顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中炎癥因子含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，計(jì)算樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸組織切片及病理評(píng)分比較

光鏡下：S組腸黏膜絨毛完整光滑，皮下間隙無(wú)擴(kuò)張、無(wú)充血、水腫，未見或極少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；I/R組和NS組腸黏膜絨毛排列不規(guī)則，黏膜及黏膜下水腫、出血，炎癥細(xì)胞滲出；P組腸黏膜充血，間質(zhì)出血較I/R組輕，黏膜缺損、斷裂現(xiàn)象較I/R組有明顯改善，腺體結(jié)構(gòu)比較清楚。Chiu氏評(píng)分結(jié)果顯示，I/R組和NS組Chiu氏評(píng)分高于S組(P<0.05)，P組高于S組(P<0.05)，但低于I/R組和NS組(P<0.05)。見圖1及表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸Chiu氏評(píng)分比較

2.2 結(jié)腸組織炎癥因子含量比較

與S組相比，I/R組和NS組大鼠結(jié)腸組織IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)升高(P<0.05)；經(jīng)丙泊酚干預(yù)后，P組大鼠結(jié)腸組織IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)均下降，且與I/R組和NS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 組織炎癥因子檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

本研究通過(guò)采用夾閉腸系膜動(dòng)脈法構(gòu)建大鼠結(jié)腸I/R模型，光鏡下可見，I/R組大鼠結(jié)腸組織發(fā)生明顯的I/R損傷(圖1)，且Chiu氏病理學(xué)損傷評(píng)分亦高于S組及NS組(P<0.05)，與Kalogeris等[7]的研究相符，證實(shí)造模成功。本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚干預(yù)I/R模型大鼠經(jīng)丙泊酚干預(yù)后的P組大鼠結(jié)腸組織肉眼和光鏡下顯示腸壁外觀、黏膜缺損/斷裂、間質(zhì)充血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理預(yù)處變化較I/R組有明顯改善，且Chiu氏評(píng)分也低于I/R組(P<0.05)，提示丙泊酚理能夠有效降低結(jié)腸I/R病理?yè)p傷。可能的機(jī)制[8-14]有：(1)降低炎癥因子以及髓過(guò)氧化物酶MPO的表達(dá)；(2)抑制NADPH氧化酶介導(dǎo)的肥大細(xì)胞激活；(3)抑制ROS的過(guò)量產(chǎn)生、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放以及線粒體去極化減輕腦缺血再灌注損傷，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)功能；(4)阻止HIF-Α激活來(lái)抑制線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激；(5)BRG-1介導(dǎo)的Nrf/HO-1轉(zhuǎn)錄因子的激活，減輕組織羥自由基和超氧陰離子的含量；(7)通過(guò)激活Nrf-2通路減輕組織脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛的積累，提高超氧化物歧化酶(SOD)的活力。

Ayazi等[15]研究指出，IL-1、IL-6、TNF-α為主要的促炎因子，其在血液循環(huán)和局部組織中的過(guò)度激活可誘發(fā)大量炎癥介質(zhì)釋放，降低機(jī)體免疫功能，引起強(qiáng)烈的全身性和局部性炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，與S組比較，I/R組和NS組結(jié)IL-1、IL-6、TNF-α含量升高(P<0.05)，故可認(rèn)為本研究設(shè)計(jì)的觀察指標(biāo)是合理的。經(jīng)丙泊酚干預(yù)后，P組大鼠結(jié)腸組織IL-1、IL-6和TNF-α的含量較I/R組均降低(P<0.05)，提示丙泊酚預(yù)處理可以通過(guò)降低結(jié)腸組織IL-1、IL-6和TNF-α含量來(lái)減輕大鼠腸缺血再灌注損傷。Idriss等[16]研究也指出，TNF-α是腸缺血再灌注損傷中釋放最早、發(fā)揮核心作用的一種內(nèi)源性炎癥介質(zhì)，通過(guò)作用于細(xì)胞膜上的可溶性受體(TNFR1與TNFR2)，激活凋亡蛋白caspase-8誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，NF-κB與相應(yīng)的DNA啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合可促進(jìn)促炎細(xì)胞因子。由此我們可推測(cè)丙泊酚是否是通過(guò)阻止NF-κB與相應(yīng)的DNA啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合來(lái)抑制促炎因子的釋放，這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Fatemeh等[17]研究證明5-HT1B/1D受體參與大鼠腸缺血再灌注炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，我們也可以進(jìn)一步推測(cè)丙泊酚是否能夠作用于5-HT1B/1D受體。本研究不足之處在于：(1)未研究不同劑量丙泊酚預(yù)處理對(duì)大鼠結(jié)腸缺血再灌注的影響；(2)未證實(shí)丙泊酚腹腔注射是否是最佳藥物處理方式；(3)未能觀察丙泊酚預(yù)處理后大鼠的存活率，以更加有利地說(shuō)明丙泊酚預(yù)處理的有效性。丙泊酚對(duì)保護(hù)腸I/R損傷作用的其他機(jī)制，需要進(jìn)一步的研究與探索。

綜上，丙泊酚腹腔注射預(yù)處理能夠減輕大鼠結(jié)腸I/R病理?yè)p傷，同時(shí)抑制腸I/R的炎癥反應(yīng)。