運動鍛煉對更年期抑郁模型大鼠行為學影響及機制研究*

呂麗華，陳登榜，曾 俊△，代呂霞△

1.武漢市精神衛生中心(武漢 430030)；2.成都醫學院(成都 610083)

抑郁癥是一種全球性的慢性神經精神障礙。據世界衛生組織統計，目前全世界約有3.5億人患抑郁癥，已成為發病率居全球第二位的疾病[1]。流行病學調查[2]顯示，女性抑郁癥的發病率大概是男性的2.5倍，尤其在45～55歲的更年期，有近46%女性罹患更年期抑郁癥。處于更年期的婦女，由于雌激素急劇減少，身體和精神出現障礙，情緒變化較大，常出現一些過激行為，給患者自身和家庭均帶來一定程度痛苦。

運動鍛煉是一種能堅持、簡單、有效的緩解機體壓力的方式。研究[3-4]顯示，運動鍛煉可增強體質、改善情緒，對身心有積極的效果。腦源性神經營養因子(brain derived neurothrophic factor，BDNF)是神經營養因子家族的成員，與抑郁發生密切相關。本研究探討運動鍛煉能否改善更年期抑郁模型大鼠的抑郁情緒，以及運動鍛煉對更年期抑郁模型大鼠血清和海馬中BDNF表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性，SD大鼠40只，體重200～240 g，購于成都達碩實驗動物有限公司。

1.2 主要實驗試劑

BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；BDNF大鼠多克隆抗體(上海碧云天生物技術有限公司)；羊抗鼠IgG抗體(北京中杉生物技術有限公司)；預染蛋白標準品(美國New England公司)；ECL化學發光試劑(德國Millipore公司)；Rat BDNF ELISA Kit分析試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物飼養 自由供水、供食，自然光照。

1.3.2 實驗分組 將大鼠隨機分成正常組、假手術組、去卵巢組、去卵巢+運動組4組，每組10只。

1.3.3 動物模型 1)卵巢摘除。通過雙側去卵巢手術構建更年期大鼠動物模型，以此模擬女性雌激素缺乏的更年期。大鼠在動物房適應1周后，術前禁食12 h，7%水合氯醛(0.5 mL/100 g)腹腔麻醉，麻醉起效后，俯臥位固定，備皮，背部肋弓下1 cm與脊柱側面1 cm相交處，開約2 cm切口，鈍性分離，暴露腹腔，找到粉紅色菜花狀的卵巢。在近子宮角位置進行結扎，切除卵巢，常規縫合，同樣方法摘除另一卵巢，待大鼠完全清醒后放回籠子。術后連續5 d，腹腔注射青霉素(20萬單位/只)預防感染。假手術組手術操作與卵巢摘除手術相同，但不切除卵巢，僅切除雙側卵巢周圍同等體積的脂肪。2)慢性不可預知溫和應激(CUMS)造模。術后2周，進行慢性不可預見應激以建構更年期抑郁大鼠模型。正常組和假手術組正常飼養，將摘除卵巢的大鼠進行造模，每天隨機給予1～2種不同刺激，持續28 d。造模過程中，同種刺激再次出現的間隔周期>5 d。刺激方法：鼠籠傾斜(將鼠籠傾斜至45°)；持續光照(通宵照明12 h)；禁食24 h；禁水24 h；氣味刺激(鼠籠內放置2個樟腦球)；旋轉刺激(置于旋轉架上旋轉3 min)；4 ℃冷水中5 min；45 ℃熱水中5 min；束縛(橡皮膏束縛四肢限制活動3 h)；無墊料24 h；潮濕墊料24 h；夾大鼠尾巴根部1 min。3)強迫游泳實驗。大鼠單獨放入透明玻璃圓缸中(高45 cm，直徑20 cm, 水深以大鼠尾巴剛好探不到底)，水溫(25±1)℃。第1天置于缸內5 min，不記錄時間。第2天5 min, 記錄大鼠保持漂浮不動的時間。強迫游泳實驗在建模結束后和運動鍛煉6周后各進行1次。建模成功的模型大鼠隨機分為去卵巢組和去卵巢+運動組。

1.3.4 運動鍛煉 去卵巢+運動組大鼠開始為期6周的水平跑臺鍛煉。運動時間45 min，第1周初始速度為10 m/min，每隔5 min速度增加3 m/min，當速度達到20 m/min后，保持20 m/min直至運動結束。第2周初始速度為15 m/min，每隔5 min速度增加3 m/min，當速度達到20 m/min后，保持20 m/min直至運動結束。第3周至第6周保持20 m/min的速度進行運動[5-6]。每周跑步5 d，周六、周日休息。其余組大鼠未給予跑步干預。

1.3.5 樣品制備 1)收集血清。大鼠麻醉后，固定，負壓抗凝管采集大鼠動脈血。樣品室溫靜置30 min，2 000 r/min，離心半徑14 cm，離心20 min，收集上清，-80 ℃保存備用。2)提取海馬。立即將各組大鼠斷頭處死，取出大腦，冰上放置1個培養皿，在培養皿中迅速將海馬組織剝離出來，-80 ℃保存備用。3)提取蛋白。腦組織解凍后，加入裂解緩沖液，低溫高速勻漿機勻漿，運行3 min，暫停3 min，重復3次。4 ℃，12 000 r/min，離心半徑14 cm，離心20 min，提取上清，即為組織的蛋白樣本，-80 ℃保存備用。 4)蛋白定量。參照上海碧云天生物技術有限公司BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行操作。用ROH2O將待測樣品進行稀釋，將準備好的標準品和樣品加入96孔板，再加入BCA工作液，充分混勻，37 ℃放置30 min。酶標儀測定各孔OD562。Excel軟件制作蛋白濃度/D值的標準曲線，導出回歸方程式。根據公式，乘以稀釋倍數，計算出樣品蛋白的實際濃度。

1.3.6 ELISA法 參照碧云天生物技術有限公司Rat BDNF ELISA Kit分析試劑盒使用說明書步驟，檢測大鼠血清BDNF含量，每個孔均作3個復孔以減少誤差。

1.3.7 蛋白質印跡技術 大鼠海馬BDNF的表達取蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液混勻；100 ℃加熱5 min；10 000 轉/min，離心半徑14 cm，離心2 min，取上清。電泳條件：5%濃縮膠區域80 V恒壓，10%分離膠區域100 V恒壓，電泳時間約為120 min。待電泳結束后，取下SDS-PAGE凝膠，剪裁跟凝膠同樣大小的PVDF膜(甲醇中浸泡10 s)；凝膠和PVDF膜放入轉膜緩沖液中浸泡30 min；按轉移電極板負極至正極方向整齊疊放3層濾紙、凝膠、PVDF膜和3層濾紙，4 ℃、200 mA恒流轉膜60 min。轉膜結束后，取出PVDF膜，4 ℃封閉過夜；1×PBST洗膜10 min×3次；加入按1∶1 000用封閉液稀釋的一抗(BDNF抗體)，4 ℃孵育過夜；1×PBST洗膜10 min×3次；加入按1∶2 000用封閉液稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG)，37 ℃搖床孵育60 min；1×PBST洗膜10 min×3次；按Millipore ECL化學發光檢測試劑盒說明書的操作步驟對膜進行顯色，觀察結果并拍照存檔。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 行為學變化

建模結束后，通過強迫游泳實驗，收集大鼠漂浮不動的時間，以明確建模是否成功。結果顯示，模型組、正常組、假手術組大鼠的不動時間分別為(153.9±1.1)、(110.2±1.8)、(113.0±1.6)s。與正常組相比，假手術組大鼠的不動時間無明顯增加，差異無統計學意義(P>0.05)。與正常組相比，模型組大鼠的不動時間明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。強迫游泳實驗結果提示更年期抑郁大鼠模型建模成功(表1)。

表1 建模結束后強迫游泳實驗總評分結果

運動鍛煉6周后，再次進行強迫游泳實驗，結果顯示，去卵巢+運動組、去卵巢組、正常組及假手術組大鼠的不動時間分別為(124.8±1.3)、(155.8±1.8)、(118.4±1.5)、(121.6±2.0) s。與正常組相比，去卵巢組大鼠的不動時間明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與去卵巢組相比，去卵巢+運動組大鼠的不動時間明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05)；強迫游泳實驗結果提示，中等強度的運動鍛煉能有效改善更年期抑郁大鼠的情緒狀態(表2)。

表2 運動鍛煉6周后強迫游泳試驗總評分結果

2.2 大鼠血清BDNF含量

運動鍛煉6周后，ELISA檢測外周血中BDNF含量結果顯示，去卵巢+運動組、去卵巢組、正常組、假手術組BDNF含量分別為(196.5±6.5)、(132.1±2.4)、(216.7±7.6)、(199.5±6.6) μg/L。與正常組相比，去卵巢組BDNF含量明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。與去卵巢組相比，去卵巢+運動組BDNF含量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。ELISA結果證實中等強度的運動鍛煉能明顯增加更年期抑郁大鼠外周血BDNF的含量(表3)。

表3 運動鍛煉6周后血清BDNF含量

2.3 大鼠海馬BDNF的表達量

運動鍛煉6周后，蛋白質印跡技術進一步檢測各組大鼠海馬BDNF的表達量，并使用Image Lab軟件分析條帶灰度值，本研究將目標蛋白與內參條帶灰度值的比值作為目標蛋白相對表達量。結果顯示，去卵巢+運動組、去卵巢組、正常組、假手術組BDNF相對表達量為(0.520±0.010)、(0.358±0.011)、(0.616±0.015)、(0.588±0.006)。與正常組相比，去卵巢組BDNF相對表達量明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)；與去卵巢組相比，去卵巢+運動組BDNF相對表達量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。蛋白質印跡技術結果證明，中等強度的運動鍛煉能明顯增加更年期抑郁大鼠海馬BDNF的表達(圖1、表4)。

圖1 蛋白質印跡技術檢測海馬BDNF的表達

表4 運動鍛煉6周后海馬BDNF相對的表達量

3 討論

隨著社會的進步，人們工作、生活壓力劇增，我國女性抑郁癥的發生率也不斷增加，其中更年期女性尤為突出。更年期由于激素水平變化，女性易出現心血管、內分泌等身體機能的疾患，還可出現抑郁焦慮等心理問題，嚴重影響女性的健康與生活。高兵等[7]調查了110名圍絕經期婦女，結果顯示，出現抑郁癥狀的婦女約35.5%，其中具有輕度抑郁癥狀的婦女約76.9%；抑郁癥狀與更年期綜合征癥狀具有明顯的相關性。黃銀娟[8]調査發現，家庭、生活環境、社交關系、自我調節能力及運動、既往疾病史等因素對更年期抑郁焦慮狀況的發生均有影響作用。本研究通過卵巢切除和慢性不可預知性應激兩步法來建造更年期抑郁大鼠模型，利用強迫游泳實驗篩選具有明顯抑郁癥表現的大鼠，以避免去卵巢組和去卵巢+運動組里出現輕度抑郁或正常大鼠，使實驗結果更具有可信度[9]。實驗結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠的不動時間明顯增加，這與既往研究[9]具有一致性。

藥物和電休克等是目前臨床常用的抑郁癥治療方式，但由于不良反應大，導致患者依從性差，促使研究者們努力尋找更有效的治療方式。研究[10]認為，運動鍛煉作為一種簡單有效、不良反應極少的治療方式，可有效緩解抑郁癥患者的癥狀，改善患者的情緒狀態。Dunn等[11]認為，在抑郁癥的治療中，運動鍛煉的類型、持續時間及運動頻率等因素會產生不同的效果。長時間、高強度的運動鍛煉由于過度激活HPA軸而使患者身心緊張，導致抑郁癥狀加重[12]；而中等強度的運動鍛煉則是減少應激的最有效方法[13]。因此本實驗采用中等強度的運動，運動鍛煉的參數在相關文獻基礎上進行了細微的調整[14]，實驗結果證實中等強度的運動鍛煉的確可以明顯改善更年期抑郁模型大鼠的情緒癥狀。

BDNF在神經細胞的生長發育和神經元的修復方面具有十分重要的作用，BDNF在海馬、杏仁核及額葉皮層等部位表達量較高。研究[15]發現，BDNF與抑郁癥的發生密切相關，應激可引起腦邊緣系統(如海馬、前額葉皮質)BDNF蛋白表達明顯下降，以及相關的邊緣系統結構萎縮。研究[16]發現，抑郁癥患者外周單核細胞BDNF mRNA的含量明顯低于正常人，且BDNF mRNA含量的下降幅度與抑郁的程度呈正比。因此外周血和中樞BDNF含量若發生一致改變，能較好揭示BDNF在抑郁癥發病中的作用。結合更年期抑郁大鼠模型，本實驗探討了外周血BDNF含量和海馬BDNF表達與更年期抑郁癥的關系，結果表明，更年期抑郁模型大鼠外周血BDNF含量和海馬BDNF的表達是同步下降；經過6周運動鍛煉后，去卵巢+運動組外周血BDNF含量和海馬BDNF的表達量較去卵巢組明顯升高。但本研究也發現，雖然6周運動鍛煉能明顯增加更年期抑郁模型大鼠外周血BDNF含量及中樞BDNF的表達，有效改善大鼠的抑郁狀態，但并未使大鼠完全恢復正常狀態，分析其原因可能是運動鍛煉的持續周期還未找到最理想的值，在下一步實驗中，我們將繼續探究運動鍛煉8、12周及更長的時間對更年期抑郁模型大鼠行為學及機制的影響。

綜上所述，本研究結果顯示，更年期抑郁模型大鼠經過6周中等強度的運動鍛煉后，情緒狀態得到明顯有效的改善；外周血BDNF含量和海馬BDNF表達量升高，為更年期抑郁治療提供了新的思路。