Ih電流在大鼠臂旁外側核熱敏神經元溫敏形成中的作用*

黃 成，綦黃鵬，楊培培，胡紅利，趙 曦，全俊如，張 潔△，林友勝△

1. 成都醫學院 基礎醫學院(成都 610500)； 2. 成都醫學院 臨床醫學院(成都 610500)

超極化激活環核苷酸門控性陽離子通道蛋白(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels，HCN)在不同類型神經元上廣泛分布，HCN介導的Ih電流可被超極化激活的環核苷酸門控通道阻斷劑ZD7288特異性阻斷[1]。哺乳動物中，HCN通道蛋白包括4種亞型即HCN1、HCN2、HCN3、HCN4，其中HCN2通道蛋白主要分布于體溫調節中樞視前區-下丘腦前部(preoptic-anterior hypothalamus，PO/AH)，HCN2通道蛋白介導的Ih電流具有溫度敏感性[2-3]，ZD7288可引起PO/AH區熱敏神經元動作電位幅度降低、放電頻率減慢、放電間期延長和溫度敏感性降低，而對溫度不敏感神經元幾乎沒有作用，提示HCN介導的Ih電流與PO/AH熱敏神經元的溫度敏感性形成有關[3]。已有研究[4-5]發現，在臂旁外側核(lateral parabrachial nucleus, LPBN)參與體溫調節的中央亞核(central subnucleus of LPBN, LPBc)、背亞核(dorsal subnucleus of LPBN, LPBd)和外亞核(external lateral subnucleus of LPBN, LPBel)均記錄到對局部腦溫變化敏感的熱敏神經元和冷敏神經元，但Ih電流是否與其溫敏形成有關尚不清楚。故本實驗采用實時定量聚合酶鏈式反應 (real-time quantitative polymerase chain reaction, real-time qPCR)鑒定雄性SD大鼠LPBN的HCN通道的主要亞型；采用免疫熒光染色的方法，觀察HCN通道主要亞型在LPBN的表達和分布；采用腦片膜片鉗技術觀察溫度變化對LPBN熱敏、冷敏和溫度不敏感神經元Ih電流的影響，以探明Ih電流在LPBN神經元溫敏形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠(80～300 g)購于成都達碩生物醫學科技有限公司。

1.2 real-time qPCR檢測HCN1、HCN2、HCN3、HCN4 mRNA表達水平

6只雄性SD大鼠經腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，將位于腦橋背外側的LPBN迅速剝離后并置于RNALater中，采用Trizol法提取組織RNA，用gDNA Eraser去除基因組DNA后，按照逆轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明書進行反轉錄得到cDNA，然后按照文獻[6]的方法進行PCR擴增。real-time qPCR使用探針選自瑞士Roche公司探針庫，擴增所需引物為該探針所匹配的特異引物(表1)。用目的基因Cq值與β-actin(內參)Cq值計算各樣本△Cq值，通過比較各目的基因的△Cq值分析基因表達的相對差異。△Cq值越高，mRNA的量越少。

表1 real-time qPCR探針及引物序列

1.3 免疫熒光染色檢測HCN2通道蛋白表達

雄性SD大鼠麻醉后，經升主動脈灌注4%多聚甲醛溶液進行預固定，制備含LPBN腦干塊，腦干塊經后固定、脫水、包埋后切片(5 μm)，行免疫熒光染色。用于免疫熒光染色的一抗為兔抗HCN2(1∶200，Alomone公司,以色列)，二抗為驢抗兔熒光二抗(Alexa488，Invitrogen公司，美國)，DAPI復染細胞核，封片，在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.4 腦片膜片鉗技術檢測Ih電流

參照文獻[4-5]的方法制備腦干塊，用振動切片機(VT1200, Leica, 德國)振動切取300 μm厚含LPBN的腦薄片。將腦片置于人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)中孵育1～2 h，ACSF由葡萄糖 10 mmol/L、NaCl 124 mmol/L、NaHCO326 mmol/L、MgSO41.3 mmol/L、CaCl22.4 mmol/L、KH2PO41.24 mmol/L、KCl 5 mmol/L組成(滲透壓 300 mmol/kg H2O，pH=7.4)。在全細胞電流鉗模式下記神經元胞內自發放電，電極內液成分為Na2GTP 2 mmol/L，葡萄糖酸鉀 130 mmol/L、CaCl21 mmol/L、MgATP 2 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、EGTA 10 mmol/L(滲透壓 290 mmol/kg H2O，pH=7.2)。根據溫度敏感系數m值(imp·s-1·℃-1)將LPBN神經元分為4類[4-5]：1)熱敏神經元 m值≥0.8；2)冷敏神經元 m值≤-0.6；3)低等斜率溫度不敏感神經元(low-slope temperature-insensitive neurons, LS-TIN)-0.2≤m值≤0.2；4)中等斜率溫度不敏感神經元(moderate-slope temperature-insensitive neurons, MS-TIN)0.2

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 HCN2通道蛋白在LPBN的表達

免疫熒光染色實驗顯示，LPBN的主要HCN通道亞型HCN2陽性表達神經元在參與體溫調節的LPBc、LPBd和LPBel 3個LPBN亞核均有分布(圖1)。

圖1 HCN2通道蛋白在LPBN的表達

2.2 大鼠LPBN HCN1～HCN4通道mRNA表達分析

6只大鼠的LPBN均有HCN1、HCN2、HCN3和HCN4 mRNA的表達。大鼠LPBN內HCN2 mRNA表達豐度最高，高于HCN1、HCN3和HCN4 mRNA水平(P<0.05)，而HCN4表達豐度最低，說明LPBN的主要HCN通道亞型是HCN2(表2)。

表2 大鼠LPBN HCN1～HCN4通道mRNA的相對含量

2.3 溫度對LPBN神經元Ih電流的作用

2.3.1 溫度對不同類型LPBN神經元Ih電流幅度的作用 本實驗在29個LPBN神經元上記錄到可被ZD7288特異性阻斷的Ih電流。結果顯示，當膜電位為-120 mV時，升溫使熱敏神經元(n=7)的Ih電流幅度明顯提高(P<0.05)。而MS-TIN(n=8)、LS-TIN(n=9)和冷敏神經元(n=5)在溫度變化時，其Ih電流幅度差異無統計學意義(P>0.05)(圖2～3)。

圖2 溫度對不同類型LPBN神經元Ih電流的作用

圖3 溫度對不同類型LPBN神經元Ih電流幅度的作用

2.3.2 溫度對不同類型LPBN神經元Ih電流τ的作用 當膜電位為-120 mV時，升溫使熱敏神經元的Ih電流τ明顯縮短(P<0.05)，但另外3種LPBN神經元在溫度變化時，其Ih電流τ值差異無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 溫度對4類LPB神經元Ih電流τ的影響

2.3.3 溫度對不同類型LPBN神經元Ih電流激活速率的作用 當膜電位為-120 mV時，升溫使熱敏神經元的Ih電流的激活速率加快(P<0.05)，但其他3類LPBN神經元在溫度變化時，其Ih電流的激活速率差異無統計學意義(P>0.05)(表4)。

表4 溫度對4類LPB神經元Ih電流激活速率的影響

2.3.4 LPBN神經元Ih電流溫度敏感性與放電頻率溫度敏感性的關系 通過對Ih電流的Q10值與放電頻率溫敏系數進行相關性分析，以反映Ih電流溫度敏感性與放電頻率溫度敏感性的關系。結果顯示，膜電位為-120 mV時，熱敏神經元Ih電流幅度的Q10值與放電頻率溫敏系數呈負相關(r=-0.25)(圖4 A)；Ih電流激活時間常數的Q10值與放電頻率溫敏系數呈負相關(r=-0.78)(圖4 B)；而Ih電流的激活速率的Q10值與放電頻率溫敏系數呈正相關(r=0.61)(圖4 C)；其他3類LPBN神經元的Ih電流的激活速率與自身放電頻率溫敏系數無相關性(圖5)。LPBN熱敏神經元Ih電流激活速率的Q10值明顯高于溫度不敏感神經元(P<0.05)。

圖5 LPBN 冷敏神經元、LS-TIN和MS-TINIh電流激活速率Q10值與放電頻率溫敏系數的關系

3 討論

HCN通道蛋白分布于不同類型的神經元上，其介導的內向Ih電流在動作電位發生中起著起搏電流的作用[1]。在哺乳動物神經元上的 4種HCN通道蛋白中， HCN2表達較廣泛，幾乎在所有神經元上均有表達；而HCN1主要在大腦皮質與海馬表達；HCN3在腦組織細胞很少表達；HCN4主要在丘腦與心臟等其他組織[1]表達。去極化前電位是影響PO/AH神經元溫度敏感性的重要因素[8-9]。溫度升高能明顯加快PO/AH熱敏神經元去極化前電位的上升速率，使膜電位更快去極化而達到閾電位，引起放電頻率加快，從而表現出熱敏性；相反，溫度的變化很少或不影響溫度不敏感神經元的前電位上升速率[8]。PO/AH熱敏神經元的前電位上升速率的溫度依賴性變化與HCN2通道介導的Ih電流激活[2-3]和A型鉀通道介導的IA電流失活加快[8]有關。前期研究[4-5]發現，LPBN有對局部腦溫變化敏感的熱敏神經元和冷敏神經元，這些神經元在參與前饋體溫調節的3個亞核LPBc、LPBd和LPBel都有分布，LPBN熱敏性與PO/AH相似，但冷敏性與PO/AH不同[5]。在LPBN神經元溫敏機制研究中發現，IA電流的溫度依賴性失活引起的前電位溫度依賴性變化參與了LPBN神經元熱敏形成，而膜電位的溫度依賴性變化參與了LPBN神經元冷敏形成[7,10]，但HCN通道介導的Ih電流是否參與LPBN神經元溫度敏感性的形成機制尚不清楚。

本實驗中，采用real-time qPCR技術在所有6只大鼠LPBN均檢測到HCN1、HCN2、HCN3和HCN4 mRNA表達，其中，HCN2 mRNA表達豐度最高，說明LPBN表達的主要HCN亞型為HCN2；免疫熒光染色技術顯示，HCN2通道在參與體溫調節的3個亞核均有表達，這為研究Ih電流參與LPBN神經元溫敏形成奠定了基礎；全細胞腦片膜片鉗實驗顯示，溫度升高引起 LPBN熱敏神經元Ih電流幅度增加、激活時間常數縮短、激活速度加快，而對LS-TIN、MS-TIN以及冷敏神經元的Ih電流激活速度無明顯影響，說明Ih電流的溫度依賴性激活可能參與 LPBN熱敏神經元的溫敏形成過程。 Q10值可反映生理指標在溫度變化10 ℃時的變化比例，繼而反映其溫度敏感性。比較分析不同類型 LPBN神經元的Ih電流 Q10值，發現 LPBN熱敏神經元Ih電流激活速率的 Q10值明顯高于溫度不敏感神經元；進一步把Ih電流 Q10值與放電頻率溫敏系數做相關性分析， 顯示熱敏神經元Ih電流激活時間常數 Q10值與放電頻率溫敏系數呈負相關， 而Ih電流激活速率的 Q10值與放電頻率溫敏系數呈正相關，Ih電流幅度 Q10值與放電頻率溫敏系數呈負相關，進一步證實 LPBN的熱敏神經元的溫度敏感性形成機制與Ih電流的溫度依賴性激活有關。

綜上所述，本研究表明，Ih電流的溫度依賴性激活參與了LPBN熱敏神經元的溫度敏感性形成，升溫加快Ih電流激活，進而加快去極化前電位上升速度和放電頻率，從而表現出熱敏性。Ih電流的溫度依賴性激活和IA電流的溫度依賴性失活，共同影響前電位上升速率，從而參與LPBN的熱敏神經元的溫度敏感性形成。