左旋紫草素對大鼠重癥急性胰腺炎并發急性心肌損傷的保護作用研究*

張 媛,關 靜，蔣 銳，肖雯婧，呼永河，侯 君△

1.西部戰區總醫院 放射診斷科(成都 610083)；2.西部戰區總醫院 藥劑科(成都 610083)；3.四川省中醫骨科與運動康復臨床醫學研究中心 (成都 610083)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP) 為臨床常見急重癥，具有發病急、病死率高、并發癥兇險的特點，易導致心、肺、肝等多器官嚴重缺血、缺氧，甚至出現成人呼吸窘迫綜合征、急性肝功能衰竭、急性腎功能衰竭及休克[1-3]。已有研究[4]表明，SAP大鼠存在心臟結構和功能改變，證明SAP可并發心肌損傷。SAP可引起炎癥因子的大量釋放，而炎癥因子的釋放與心肌功能障礙發生有關[5]。 炎性小體(NLRP3)通過激活效應蛋白天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)，促進白介素1-β(IL-1β)成熟與分泌，是固有免疫的重要構成，主要參與炎癥反應。主流研究[6-7]認為，NLRP3 的激活與活性氧簇(ROS)的產生密切相關。研究SAP并發急性心肌損害(acute myocardial injury, AMI)具體機制對臨床救治此類患者具有重要意義。

左旋紫草素是從紫草科天然植物紫草中提取的一類萘醌化合物，具有抗炎、抗真菌和抗腫瘤等作用[8-10]。課題組前期實驗[10]結果表明，左旋紫草素可抑制高糖心肌細胞壞死性凋亡，但其減輕SAP并發AMI的作用尚未見報道。本研究主要觀察SAP大鼠并發AMI時NLRP3炎性小體相關蛋白的表達，并探討左旋紫草素減輕SAP并發AMI的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

肌酸激酶同Ⅰ酶(CK-MB)；腫瘤壞死因子(TNF-α)；IL-1β酶聯免疫吸附劑測定試劑盒、左旋紫草素、二氫乙錠(DHE)、Caspase-1、NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)及β-actin一抗購自美國Sigma公司；HRP標記山羊抗兔IgG二抗、ECL化學發光底物、BCA蛋白定量盒及細胞裂解液購自武漢碧云天公司；L-精氨酸購自北京索萊寶科技有限公司；OCT包埋劑購自日本SAKURA公司。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠24只，體重220～240 g，購于成都達碩實驗動物有限公司。

1.3 造模及給藥方法

大鼠飼養于標準溫度、濕度和空氣清潔度的動物房內，造模前12 h禁食、不禁水。SAP造模方法：每只大鼠按照3.2 g/kg體重腹腔注射250 g/L的L-精氨酸2次，每次間隔1 h，第2次注射24 h后SAP模型造模成功。造模成功的SAP模型大鼠作為SAP模型組，假手術組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，左旋紫草素干預組為SAP小鼠腹腔注射20 mg/kg左旋紫草素。每組于造模后24 h收集血液、胰腺及心臟組織標本。

1.4 酶聯免疫吸附劑測定法

大鼠心臟取血2 mL，以離心半徑7 cm，轉速3 000 r/min，離心10 min后取上清，按酶聯免疫吸附劑測定法試劑盒說明書檢測CK-MB、TNF-α、IL-1β水平。

1.5 HE染色

大鼠切取小部分左室心肌及胰腺，4%多聚甲醛固定、各濃度酒精梯度脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，觀察心肌及胰腺結構變化。

1.6 心肌ROS檢測

大鼠切取左室心肌組織置入OCT包埋劑中，冰凍切片(厚度10 μm)，放置于含PBS的DHE (1.6 μmol/L) 溶液中37 ℃避光孵育30 min，在488 nm激發光，560～660 nm濾波處，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。

1.7 蛋白質印跡技術

大鼠左室心肌經RIPA裂解液提取蛋白，BCA法定量蛋白，SDS-PAGE電泳后轉膜30 min。5% 脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Caspase-1、NLRP3、ASC以及β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜；TBST洗膜，二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，ECL顯色，Image J 圖像分析軟件對曝光圖像進行光密度分析。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 HE染色

2.1.1 胰腺組織 假手術組胰腺結構正常；SAP模型組胰腺間質水腫，可見一定炎性細胞表達，小葉輪廓被破壞類似孤島樣分布；左旋紫草素干預組胰腺β細胞水腫程度較SAP模型組明顯降低，炎性細胞減少，胰腺結構趨于正常(圖1)。

圖1 各組胰腺 HE染色(×400)

2.1.2 心肌組織 假手術組心肌結構正常；SAP模型組心肌腫脹明顯，肌纖維排列紊亂，肌膜破裂；左旋紫草素干預組較SAP模型組心肌腫脹程度減輕，橫紋較心肌纖維清晰，細胞排列結構趨于正常(圖2)。

圖2 各組心肌HE染色(×400)

2.2 大鼠血清CK-MB、TNF-α、IL-1β水平

SAP模型組大鼠血清CK-MB、TNF-α及IL-1β水平較假手術組明顯增高 (P<0.05) ；左旋紫草素干預組CK-MB、TNF-α、IL-1β水平較SAP模型組明顯下降 (P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠造模后 24 h 血清 CK-MB、TNF-α 、IL-1β水平變化比較

2.3 大鼠心肌Caspase-1、NLRP3、ASC蛋白水平

蛋白質印跡技術結果顯示，SAP模型組大鼠心肌NLRP3、Caspase-1及ASC蛋白表達量較假手術組明顯增高(P<0.05)；左旋紫草素干預組大鼠心肌 NLRP3、Caspase-1及ASC蛋白表達量明顯低于SAP 模型組(P<0.05) (圖 3)。

圖3 各組心肌Caspase-1、NLRP3及ASC表達

2.4 心肌ROS含量

與假手術組相比，SAP模型組心肌組織氧化應激反應增強，表現為DHE的熒光信號放大(P<0.05)；左旋紫草素干預組能明顯減少心肌組織內ROS堆積(P<0.05)(圖4)。

圖4 各組心肌ROS水平(×400)

3 討論

當心肌細胞膜完整性遭到破壞時，胞質內游離的CK-MB在3～6 h后可在外周血中檢測出異常[11]，使SAP從最初的局部胰腺炎癥擴展為全身炎癥反應，包括心臟、肝臟、腎臟等。心肌炎癥反應是SAP并發AMI的最重要的病理表現之一。SAP早期，急性炎癥因子TNF-α足量產生并迅速升高，通過多種途徑加重心肌損傷，比如刺激血管內皮細胞表達細胞間黏附分子1(ICAM-1)分泌、促進內皮-白細胞黏附分子(ELAM-1)表達、誘導IL-6產生發揮細胞因子放大效應、通過與其受體結合激活NF-KB通路等[12-14]。本研究結果表明，SAP早期存在較明顯的AMI，血清心肌特異性指標CK-MB濃度升高，心肌細胞腫脹和間質水腫程度增加。經左旋紫草素干預治療后，SAP血清TNF-α水平和CK-MB濃度降低，同時也減輕了大鼠心肌損害的形態學改變，心肌細胞腫脹和間質水腫程度得到明顯改善，阻斷了這一炎癥起始因子的破壞作用，保護了SAP并發AMI導致的急性心肌損傷，差異有統計學意義(P<0.05)。實驗結果表明，SAP時心肌組織活性氧ROS的產生明顯增加，伴隨NLRP3炎性小體復合物中Caspase-1 活性及其下游產物IL-1β的含量明顯升高，表明NLRP3炎性小體在SAP并發AMI中扮演重要的作用；同時蛋白質印跡技術實驗結果也證實,NLRP3炎性小體相關蛋白表達均升高，NLRP3炎性小體被過度活化，上述結果均表明ROS是NLRP3炎性小體激活調控的核心，過量的ROS可直接激活NLRP3炎性小體，是炎癥相關疾病發生的關鍵環節[15]，調控ROS有望成為控制NLRP3炎癥小體激活和治療炎癥相關疾病的重要靶點。

綜上所述，左旋紫草素減輕SAP 大鼠并發AMI的作用可能是通過抑制NLRP3炎性小體過度活化，降低心肌炎癥反應來實現，本研究為左旋紫草素可能成為NLRP3炎性小體的抑制劑奠定了實驗基礎。