線粒體絲氨酸蛋白酶抑制MPTP誘導小鼠帕金森病的研究*

李小雙，太顥然，蘇炳銀△，李淑蓉

1.成都醫(yī)學院 發(fā)育與再生重點實驗室(成都 610500)；2.成都醫(yī)學院 人體解剖與組織胚胎學教研室(成都 610500)；3.成都醫(yī)學院 病理學與病理生理學教研室(成都 610500)

帕金森病(Parkinson's disease, PD)是世界第二大神經退行性疾病[1]，其病理表現為中腦黑質多巴胺能神經元變性，出現靜止性震顫、肌強直、運動遲緩、平衡障礙等[2]。研究[3]認為，PD是由多種風險和致病因素(遺傳和環(huán)境因素)導致的多因素疾病。目前PD治療手段單一，傳統的替代治療雖可一定程度減輕癥狀，但需長期甚至終生用藥。長期藥物治療易誘發(fā)神經、消化、心血管系統等不良反應，嚴重影響PD患者生活質量。

線粒體絲氨酸蛋白酶(high temperature requirement A2，HtrA2/Omi)正常情況下定位在線粒體雙側膜結構之間，通過折疊錯誤、剪切和清除變性蛋白，維持線粒體結構和功能穩(wěn)定；在線粒體受損和通透性增加的情況下，HtrA2/Omi能夠被釋放到細胞質，通過含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)依賴性和非依賴性機制促進細胞死亡[4-5]。HtrA2/Omi在神經系統中起著重要的保護作用，HtrA2/Omi失活的mnd2小鼠和HtrA2/Omi敲除小鼠表現出黑質紋狀體的多巴胺能神經元丟失和PD樣癥狀[6-7]。在部分PD患者中，檢測到HtrA2/Omi突變[8]。HtrA2/Omi激活還受PD相關激酶PINK1介導的HtrA2/Omi磷酸化的調控[9]。此外，PD的發(fā)生與氧化應激密切相關[10--11]。有研究[12]證明，HtrA2/Omi參與了細胞的應激過程，發(fā)揮了細胞保護作用。研究[13]表明，過表達HtrA2/Omi的細胞在對過氧化氫應激時可增強細胞抵抗。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)的代謝產物1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridin-1-iuM iodide，MPP+)通過多巴胺轉運蛋白被轉運到神經元的線粒體中，導致線粒體功能障礙使多巴胺能神經元丟失[14]，多巴胺能神經元的丟失或變性是PD的主要病理改變，因此，MPTP常被用于PD的動物模型構建。為進一步驗證HtrA2/Omi的體內效應，本研究通過腹腔注射MPTP構建PD小鼠模型[15-16]，尾靜脈注射腺相關病毒AAV9-HtrA2/Omi過表達HtrA2/Omi，觀察過表達HtrA2/Omi的小鼠體內應激反應，探索過表達HtrA2/Omi小鼠在MPTP誘導下PD模型小鼠中多巴胺能神經元的改變。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 12月齡雄性C57BL小鼠16只，體重(32.0±1.8)g，隨機分為生理鹽水組(5只)、MPTP組(5只)和MPTP+HtrA2/Omi組(6只)。動物飼養(yǎng)采用清潔級標準，每周更換1次墊料、飲水。實驗動物的處理與操作均嚴格按照國際衛(wèi)生研究機構的倫理指南進行，通過成都醫(yī)學院動物實驗倫理委員會批準，實驗動物均在麻醉下進行，以減少其疼痛。

1.1.2 實驗試劑 MPTP購自美國Sigma公司，GAPDH(ab8245)多克隆抗體、HtrA2/Omi(ab75982)單克隆抗體購自英國Abcam公司，酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)(25085)、α突觸核蛋白(AB5038)購自德國Merck公司，AAV9-HtrA2/Omi(48262-1)腺相關病毒(每只5×108vg/L)，購自上海吉凱基因，胎牛血清購自美國Gibco公司，改進型檸檬酸鈉抗原修復液購自江蘇碧云天公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物模型 MPTP+HtrA2/Omi組小鼠注射AAV9-HtrA2/Omi腺病毒載體，注射前使用滅菌后PBS稀釋病毒，每只小鼠注射病毒量約2×108vg/L，注射后觀察0.5 h。在注射病毒2周后，MPTP組和MPTP+HtrA2/Omi組小鼠按每只20 mg/kg腹腔注射MPTP，構建PD小鼠模型，生理鹽水組用等量生理鹽水作為對照，1次/d，連續(xù)注射2周。

1.2.2 行為學檢測 HtrA2/Omi注射2周后，對小鼠進行轉棒實驗和爬桿實驗。1)轉棒實驗：在MPTP注射前3 d，對小鼠進行轉棒實驗訓練，計時1 min，轉棒速度從0開始逐步加速到30 r/min，記錄小鼠在棒時間(s)，每次結束后休息1 min，重復訓練5次。每次記錄前1 d按上述方法訓練小鼠，每隔1周記錄1次，每次記錄在同一時間段進行，連續(xù)記錄3次。2)爬桿實驗：將直徑為2 cm塑料小球固定于1根長60 cm、粗1 cm的木桿頂端，木桿上纏繞2層紗布，防止打滑。使小鼠四爪接觸木桿頂端，松手，開始計時，記錄小鼠從頂端滑到底部的時間(s)，每次記錄在同一時間段進行，連續(xù)記錄3次。

1.2.3 小鼠腦組織綠色熒光檢測 MPTP+HtrA2/Omi組小鼠在尾靜脈注射腺相關病毒AAV9-HtrA2/Omi過表達HtrA2/Omi 4周后，取3組小鼠腦組織，進行固定、脫水、包埋、冰凍切片，干燥箱37 ℃烘片1 h，烘干后PBS洗3次，每次10 min，含DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片，在BX-63正置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達。

1.2.4 小鼠組織免疫熒光檢測 用4% PFA灌注，取小鼠腦組織進行固定、脫水、包埋、冰凍切片。選3組小鼠同一層面的中腦組織切片，干燥箱37 ℃烘片1 h，烘干后PBS洗3次，10 min/次，在電磁爐中用改進型檸檬酸鈉抗原修復液進行抗原修復，煮沸20 min，自然冷卻至室溫，PBS洗3次，用950 μL PBS、50 μL馬血清、5 μL 0.5% TritonX-100配制的封閉液，4 ℃封閉1 h，一抗工作液4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，10 min/次，常溫下二抗避光孵育2 h，PBS洗3次，10 min/次，含DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片，鏡下觀察。

1.2.5 組織蛋白免疫印跡實驗 用新加入1%PMSF的RIPA裂解液裂解新鮮組織收集蛋白樣品，用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白濃度，取20 μg蛋白加入適量的1× SDS-PAGE上樣緩沖液，加入10%丙烯酰胺凝膠進行電泳。垂直電泳溴酚藍燃料到達底部后，50 V恒壓冰浴轉膜2 h，用含5%脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline tween-20，PBST)室溫封閉1 h，PBST漂洗10 min，一抗稀釋液稀釋的一抗工作液4 ℃孵育過夜，PBST洗3次，10 min/次，常溫下二抗孵育2 h，PBST漂洗3次，每次10 min/次。電化學發(fā)光液(electrochemiluminescence，ECL)按A液∶B液=1∶1配制，滴于PVDF膜上，成像顯影。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠行為功能檢測

生理鹽水組、MPTP組和MPTP+HtrA2/Omi組間小鼠在棒時間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。隨著MPTP注射時間的增加，MPTP組小鼠在棒時間逐漸縮短，表明持續(xù)腹腔注射MPTP導致小鼠出現行為功能障礙。MPTP+HtrA2/Omi組0周時小鼠在棒時間明顯低于生理鹽水組和MPTP組；隨著MPTP注射時間延長，MPTP+HtrA2/Omi組小鼠在棒時間逐漸增加，第2周時，生理鹽水組小鼠在棒時間高于MPTP組，MPTP+HtrA2/Omi組小鼠在棒時間高于MPTP組，表明HtrA2/Omi的表達可改善小鼠因MPTP導致的運動能力減退(表1)。

表1 3組小鼠轉棒實驗結果

C57BL雄性小鼠在開始注射MPTP藥物時，生理鹽水組和MPTP組小鼠爬桿時間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；隨著MPTP注射時間的延長，MPTP組小鼠爬桿時間較生理鹽水組小鼠縮短(P<0.05)；而在MPTP+HtrA2/Omi組小鼠中，持續(xù)MPTP注射后小鼠爬桿時間先出現短暫下降后又出現增加，表明HtrA2/Omi可改善小鼠因MPTP導致的行為能力障礙(表2)。

表2 3組小鼠爬桿實驗結果

2.2 小鼠腦組織GFP表達

3組小鼠腦組織GFP結果顯示，生理鹽水組和MPTP組未檢測到GFP，MPTP+HtrA2/Omi組中觀察到GFP熒光，表明小鼠在注射腺相關病毒AAV9-HtrA2/Omi第4周后，HtrA2/Omi在小鼠腦組織中成功表達(圖1)。

圖1 3組小鼠中腦組織GFP表達

2.3 過表達HtrA2/Omi對MPTP所致中腦黑質多巴胺能神經元的作用

3組小鼠在腹腔注射MPTP 2周后，檢測各組同一層面的腦組織切片TH免疫熒光，MPTP組小鼠中腦多巴胺能神經元TH陽性細胞較生理鹽水組小鼠明顯減少，MPTP+HtrA2/Omi組小鼠中腦多巴胺能神經元TH陽性細胞數多于MPTP組，但少于生理鹽水組。對3組中腦組織蛋白免疫印跡檢測發(fā)現，MPTP可使TH蛋白表達量減少，而過表達HtrA2/Omi后，可減輕MPTP導致的TH蛋白減少，表明過表達HtrA2/Omi后，可減緩MPTP導致的小鼠中腦多巴胺能神經元的減少，緩解因MPTP導致的TH蛋白表達的減少(圖2、表3～4)。

圖2 3組小鼠中腦多巴胺能神經元檢測

表3 3組小鼠中腦多巴胺能神經元TH陽性細胞免疫熒光結果(個，

表4 3組小鼠中腦組織TH與GAPDH灰度值比值結果

2.4 過表達HtrA2/Omi對α突觸核蛋白的作用

用免疫熒光檢測3組小鼠腦組織同一層面切片中α突觸核蛋白聚集情況顯示，MPTP組小鼠中腦α突觸核蛋白聚集多于生理鹽水組，MPTP+HtrA2/Omi組小鼠中腦α突觸核蛋白聚集少于MPTP組，但多于生理鹽水組。在長時間MPTP誘導的小鼠PD模型中，小鼠中腦α突觸核蛋白聚集增多，MPTP+HtrA2/Omi組小鼠α突觸核蛋白比MPTP組減少，表明過表達HtrA2/Omi可減輕MPTP所致中腦α突觸核蛋白聚集(圖3、表5)。

圖3 3組小鼠中腦組織α突觸核蛋白免疫熒光

表5 3組小鼠中腦組織α突觸核蛋白免疫熒光結果(個,

3 討論

PD是僅次于阿爾茨海默病的世界第二大神經退行性疾病，多發(fā)于老年人，隨著年齡增加其發(fā)病率成倍增加[1,17]。PD起病隱匿，早期較難診斷，對于緩慢進展者則可表現出靜止性震顫、運動遲緩、肌張力升高等表現，臨床較易診斷。目前以左旋多巴、抗膽堿能藥物、金剛烷胺等多巴胺前體等替代治療作為PD的首選治療。PD患者需長期乃至終生服藥，而長期用藥容易造成神經、消化、心血管系統等不良反應[18-19]。很多口服藥物難以通過血腦屏障，因此PD治療很難獲得理想療效，因而探索潛在的治療途徑和靶點，對PD患者治療疾病、改善臨床癥狀，提高生活質量有重要意義。研究[20-21]表明，HtrA2/Omi突變可能與PD等神經退行性疾病有關，在HtrA2/Omi活性缺失的mnd2小鼠中，可出現神經退行性改變。為驗證HtrA2/Omi在PD中的效應，利用腺相關病毒AAV9-HtrA2/Omi構建HtrA2/Omi過表達小鼠；同時以MPTP腹腔注射構建小鼠PD模型，觀察HtrA2/Omi對PD中腦黑質多巴胺能神經元的影響，旨在發(fā)現潛在的臨床治療思路。

本研究結果表明，HtrA2/Omi過表達后小鼠未出現明顯異常情況，通過檢測AAV9-HtrA2/Omi熒光，提示HtrA2/Omi過表達模型構建成功。在MPTP腹腔注射構建PD小鼠模型時，小鼠未出現死亡，但在MPTP注射后小鼠出現行為能力減弱，進一步比較生理鹽水組、MPTP組、MPTP+HtrA2/Omi組MPTP注射2周后的情況，發(fā)現HtrA2/Omi過表達小鼠在活動能力(爬桿實驗、轉棒實驗)方面較MPTP組有一定改善。在對3組同一位置層面的中腦多巴胺能神經元進行TH免疫熒光檢測發(fā)現，MPTP組出現TH陽性神經元明顯減少，而HtrA2/Omi的過表達減輕了中腦多巴胺能神經元的大量丟失。α突觸核蛋白在許多神經變性疾病中發(fā)揮重要作用，α突觸核蛋白是α突觸核蛋白聚合物的重要組分，是PD的病理特征之一。3組中腦多巴胺能神經元染色細胞計數統計顯示，生理鹽水組與MPTP組、MPTP+HtrA2/Omi組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；且MPTP組與MPTP+HtrA2/Omi組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，說明HtrA2/Omi過表達的小鼠可減緩因MPTP所致中腦黑質多巴胺能神經元的大量丟失，起到神經保護作用。3組小鼠腦組織α突觸核蛋白聚集檢測發(fā)現，生理鹽水組α突觸核蛋白聚集明顯低于MPTP組、MPTP+HtrA2/Omi組，且過表達HtrA2/Omi的小鼠中，α突觸核蛋白聚集少于MPTP組，對3次不同重復試驗相同面積腦組織α突觸核蛋白免疫印跡點進行計算統計也發(fā)現，3組差異均有統計學意義(P<0.05)，且MPTP組與MPTP+HtrA2/Omi組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，說明過表達HtrA2/Omi后可減少因MPTP誘導的PD小鼠中α突觸核蛋白的聚集[22-23]。

綜上所述，在MPTP誘導的PD模型小鼠中，過表達HtrA2/Omi可減少中腦多巴胺能神經元的丟失，減輕腦組織中α突觸核蛋白的聚集，可一定程度改善小鼠行為能力。