杭州地區葡萄炭疽菌的分離與生物學特性

肖文斐， 柴偉國， 忻雅， 來文國， 阮松林， 裘劼人

(杭州市農業科學研究院，浙江 杭州 310024)

葡萄汁多味美、營養豐富，是我國的主要果品之一，也是杭州地區的主栽水果。目前，杭州市葡萄種植面積約為1 300 hm2[1]。葡萄炭疽病是一種分布廣泛的重要病害，給生產帶來巨大損失[2-3]。引起葡萄炭疽病的病原主要為膠孢炭疽菌，存在豐富的遺傳多樣性，不同地區、不同栽培條件下菌落形態、菌落生長速率、產孢量、致病力等差異顯著[4-6]。因此，本研究通過對杭州地區葡萄炭疽菌的分離和生物學特性的分析，為當地該病害防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與鑒定

在杭州市臨安區橫街村葡萄園采集具有葡萄炭疽病典型病癥的葉片和果實，用自來水洗凈表面，再用75%乙醇消毒1 min，1%次氯酸鈉消毒10 min，無菌水沖洗3遍，置于無菌濾紙上吸干表面水分。切取葉片或果實病健交界處無明顯病變的組織，于馬鈴薯葡萄糖培養基上25 ℃黑暗培養。培養5 d后，用無菌接種針挑取平板上菌絲及分生孢子進行顯微觀察，拍照記錄菌落數量及孢子生長狀態。將鑒定正確的菌株在馬鈴薯葡萄糖培養基上純化培養，用于后續生物學特性研究。

1.2 不同培養基對菌落生長及產孢的影響

配置馬鈴薯葡萄糖培養基、馬鈴薯蔗糖培養基、葡萄糖蛋白胨培養基、蔗糖蛋白胨培養基、酵母葡萄糖產孢培養基共計5種培養基。在無菌條件下用打孔器將純化培養7 d的病原菌打成直徑為5 mm的菌餅，接種到不同營養類型培養基上，每個處理設置3個重復，置于25 ℃恒溫條件下培養。逐日測量菌落直徑，觀察菌落生長狀況，7 d后用血球計數板計測病菌產孢量。

1.3 不同pH值對菌落生長及產孢的影響

以馬鈴薯葡萄糖培養基為供試培養基，用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH調配成3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 7個不同pH值的培養基。在無菌條件下用打孔器將純化培養7 d的病原菌打成直徑5 mm的菌餅，接種到不同pH值的培養基上，每個處理設置3個重復，置于25 ℃恒溫條件下黑暗培養，逐日測量菌落直徑，觀察菌落生長狀況，7 d后用血球計數板計測病菌產孢量。

1.4 光照對菌落生長及分生孢子的影響

在無菌條件下用打孔器將純化培養7 d的病原菌打成直徑5 mm的菌餅，接種到馬鈴薯葡萄糖培養基(pH 6.0)上，25 ℃恒溫條件下分別進行黑暗及光照培養，逐日測量菌落直徑，觀察菌落生長狀況，7 d后用血球計數板計測病菌產孢量。

1.5 數據統計分析

使用DPS 16.05統計分析軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄炭疽菌的分離及形態鑒定

隨機選取多份甬優1號葡萄發病果實進行病原菌的分離純化培養，共獲得5個純菌落，經形態學觀察發現：菌落在馬鈴薯葡萄糖培養基平板上呈圓形或近圓形，初期正面菌絲為灰白色，背面為深灰色，邊緣橙黃色。培養10 d左右，代謝產物大量積累，菌落背面有大量黑色素形成的同心輪紋或斑塊，中央有少量黑色素生成，產生分生孢子盤，分生孢子溢出形成橘紅色黏孢子團。分生孢子呈現圓柱形或橢圓形，無色單胞，長軸為10.0～15.0 μm，短軸為4.0～6.0 μm。從孢子形態、大小及附著胞形態等特征可推斷杭州葡萄炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌(圖1)。

圖1 菌株在馬鈴薯葡萄糖培養基上的菌落及孢子形態

2.2 不同培養基對葡萄炭疽菌生長及產孢的影響

病原菌菌絲在馬鈴薯葡萄糖培養基上長勢最好，菌絲厚重生長快，產孢能力強；其次為馬鈴薯蔗糖培養基，菌絲生長也較為致密，產孢較多；而酵母葡萄糖培養基，菌絲生長稀疏，初始產孢多，后續產孢少，且分生孢子形態更為細長。葡萄糖蛋白胨與蔗糖蛋白胨培養基類似，菌絲生長較慢，產孢能力差；其中蔗糖蛋白胨培養基產生的分生孢子有15%左右的畸形率(表1)。葡萄糖作為碳源，比蔗糖更有利于該菌株的生長與產孢。

表1 不同培養基對葡萄炭疽菌生長及產孢的影響

2.3 培養基不同pH值對葡萄炭疽菌生長及產孢的影響

比較發現，該菌株在pH 5.0～9.0的馬鈴薯葡萄糖培養基生長和產孢情況良好，其中pH值7.0和8.0最為合適，菌絲生長和產孢情況最佳，而pH值4.0以下菌絲生長緩慢，也不利于產孢(表2)。

表2 培養基不同pH值對葡萄炭疽菌生長及產孢的影響

2.4 光照對葡萄炭疽菌生長及產孢的影響

光照培養更能促進該菌株的菌絲生長和產孢，但與黑暗培養差異不顯著(表3)。

表3 光照對葡萄炭疽菌生長及產孢的影響

3 討論

研究表明，膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌等多種病原真菌可引起葡萄炭疽病[7]，在我國膠孢炭疽菌是引起葡萄炭疽病的優勢種。目前北京、山東、河北、河南、廣西、新疆及遼寧等葡萄產區鑒定的葡萄炭疽病病原均為膠孢炭疽菌[8]，宗宇等[9]也確定了引起金華地區葡萄炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌。本研究分離的杭州地區葡萄炭疽菌，在菌絲形態特征上與金華菌株不太一致，其菌落和分生孢子形態更接近鄧維萍等[10]分離的云南地區C組葡萄炭疽菌。

本研究分離的病菌在馬鈴薯葡萄糖培養基上菌絲生長最好，產孢量最大。以葡萄糖作為碳源比蔗糖更利于病原菌生長和產孢。該菌在pH 3.0～9.0菌絲能夠生長，在pH 4.0～9.0能夠產生分生孢子，其生長適宜pH是5.0～9.0，菌絲生長最適pH為7.0，pH 8.0最適合其產孢，這與新疆葡萄炭疽病菌最適pH 6.0有所不同[11]。

膠孢炭疽菌具有復合種和種群集合的特征，前人的研究表明該復合種群種內遺傳分化導致其多樣性豐富[12]，這可能是本研究與文獻[9,11]研究結果不一致的原因之一。后續將通過rDNA-ITS序列分析等方法對該菌株進行分子驗證，以進一步明確其分類地位。