寡糖·鏈蛋白浸種對菜豆根腐病的防控效果

陳利民， 吳倩倩， 何天駿， 潘逸明， 陳婷婷， 吳全聰*

(1.麗水市農林科學研究院，浙江 麗水 323000； 2.福建農林大學 閩臺作物有害生物生態防控國家重點實驗室，福建 福州 350002；3.浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江 杭州 311300； 4.麗水學院 生態學院，浙江 麗水 323000)

菜豆(PhaseolusvulgarisL.)作為我國食用豆科作物種植面積排名前三的作物，廣泛種植于全國各種植區。自古以來，菜豆在我國傳統農業和可持續農業的種植體系中均發揮著重要的作用[1]。但是隨著規模化種植年限的增加，種植面積的不斷擴大，以及近年來新品種育種過分追求產量目標而忽略了對抗病蟲種質資源的利用和保護，致使由腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxyporum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、鏈格孢(AlternariaNees)、疫霉(Phytophthora)、齊整小菌核(Sclerotiumrolfsii)、禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)等病原菌單獨或復合侵染引起的根腐病發生呈逐年加重趨勢[2]，已嚴重影響到世界各菜豆種植區的菜豆產量。據報道，我國部分菜豆種植區由根腐病引起的菜豆損失高達84%，部分非洲種植區高達100%[3]。

菜豆根腐病初發病時主根上出現紅色至棕色條紋，逐漸形成損傷和壞死。隨著菜豆植株的生長，開花結莢后癥狀逐漸明顯，根腐病呈逐漸加重趨勢，表現為菜豆植株自基部葉片開始枯萎發黃，最終導致根部完全腐爛。當前實際生產過程中多以化學藥劑防控為主，但是由于鐮刀菌針對性藥劑偏少，且菜豆根腐病多為多種病原菌復合侵染所致[4]，致使傳統化學防控效果普遍偏差。不僅如此，在菜豆根腐病的防控過程中，多以化學藥劑直接灌根為主，大量化學藥劑直接施用于土壤中，極易對生態環境造成不可逆的嚴重污染，甚至危及人類健康和生命安全。作為一種新型的植物病蟲害防控策略，植物免疫激活調節劑的應用受到越來越多的關注，其中尤以6%寡糖·鏈蛋白應用最為廣泛，并且在小麥、水稻、煙草、西瓜、葡萄等作物上均有較好的應用與推廣[5-10]，在菜豆及根腐病防控方面鮮有報道。基于此，本研究分別用6%寡糖·鏈蛋白20、80、200、500、1 000倍液浸泡種子，對菜豆根腐病防控效果及抗性相關酶活力的影響進行了系統比較，以期為科學、綠色防控菜豆根腐病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料及處理

6%寡糖·鏈蛋白(阿泰靈)植物免疫激活劑由中國農業科學院植物保護研究所廊坊農藥中試廠提供。試驗所用試劑均為分析純級，所用水為超純水(ddH2O)，化學品從上海生工生物科技有限公司(上海，中國)或Sigma Chemical Do.(St. Louis，MO，USA)購買。所用菜豆品種為麗蕓2號，盆栽所需土壤取自菜豆連作5 a以上且根腐病發生嚴重田塊，土壤陰至微干后過5目篩備用。

本試驗培養條件同6%寡糖·鏈蛋白誘導菜豆抗根腐病效果比較步驟。試驗處理前種子均采用清水于28 ℃下浸種12 h，選取吸水充分，且無損傷的種子用于試驗。試驗設6個處理，T1為6%寡糖·鏈蛋白20倍液、T2為6%寡糖·鏈蛋白80倍液、T3為6%寡糖·鏈蛋白200倍液、T4為6%寡糖·鏈蛋白500倍液、T5為6%寡糖·鏈蛋白1 000倍液、CK為清水浸泡種子10 min。各處理浸泡完成后，于定性濾紙上晾干后用于播種，每組處理20盆盆栽菜豆，設置3個生物學重復。本試驗于晝/夜溫度為(25±1)℃/(18±1)℃，光周期L/D為16 h/8 h，相對濕度為60%±5%的環境下進行。播種后每天檢查種子萌發情況并記錄，并于出苗后14 d檢查各處理幼苗根腐病發病病情指數。

1.2 測定內容及方法

播種間隔12 h記錄菜豆出苗情況，計算出苗率。在菜豆出苗后7 d，隨機挖取9株測量根系長度。采用SPAD-502 Plus葉綠素測定儀測葉綠素含量，每片葉片各測5個點，隨機調查9株。于播種后9 d采集菜豆根系、葉片，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于測量根系活力及各類抗性相關酶活性。將完整的根洗凈，用濾紙蘸去其上的水分，采用TTC法測定其根系活力[5]。β-1,3-葡聚糖酶的測定方法參考余永廷[11]的方法，用葡萄糖為標準品制作標準曲線，得到標準曲線方程為Y=1.552x-0.047(R2=0.994)，根據曲線計算樣品產生的葡萄糖量。多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定參照棉花的測定方法[12]。幾丁質酶活性檢測參照左豫虎[13]對大豆的測定方法。

菜豆根腐病分級標準參照蕓豆根腐病分級標準[3]。0級：植株莖基部和主根均健康無褐色病斑；1級：莖基部和主根上有少量褐色病斑；3級：莖基部或主根上褐色病斑較多，褐色病斑面積占莖和根總面積的25%～50%；5級：莖基部及主根上病斑多且較大，病斑面積占莖基部和根總面積的51%～75%；7級：莖基部或主根上病斑連片，形成繞莖現象，但根系并未死亡失活；9級：根系壞死，植株地上部萎蔫或死亡。

1.3 數據統計與分析

試驗所得數據采用統計分析軟件SPSS 19.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)與Microsoft Excel 2010進行。

2 結果與分析

2.1 對菜豆出苗率的影響

經不同濃度6%寡糖·鏈蛋白浸種后菜豆出苗率存在差異。出全苗前，隨著時間的延長，各處理出苗率均不同程度低于CK。播種后12 h各處理均無菜豆出苗；24 h CK出苗率達100%，且與T1和T2存在顯著性差異，其他各處理出苗率均達80%以上，且與T1存在顯著性差異；36 h T5出苗率亦達到100%，此時除T1外其他各處理出苗率均達90%以上，且T1出苗率顯著性低于其他各處理；48 h T4出苗率亦達到100%，T1出苗率為80.6%，為各處理出苗率最低，且顯著低于T2、T4、T5和CK(表1)。

表1 不同濃度6%寡糖·鏈蛋白浸種后菜豆的出苗率

2.2 對菜豆生理指標的影響

葉綠素含量各處理間無明顯差異，以T1和T2含量相對較高。各處理間根系長度雖無顯著性差異，但以T5和T4根系相對較長，且各試驗處理根系均長于CK。各處理間根系活力差異相對較大，隨著稀釋倍數的增加，根系活力呈現先減少后增加的趨勢，其中T3根系活力顯著性低于T1、T5和CK，同時CK根系活力顯著性高于T4(圖1)。

柱上無相同字母者表示組間差異顯著(P<0.05)。

2.3 對菜豆抗性相關酶活的影響

在出苗后7 d經不同稀釋倍數6%寡糖·鏈蛋白浸種處理后播種的菜豆幼苗，在抗性相關酶活性方面存在較大差異。CK、T2和T3的菜豆葉片中，β-1,3-葡聚糖酶活性顯著高于T1和T5，在根部表現出相似的趨勢；隨著稀釋倍數的增加菜豆葉片和根部PPO酶活性呈下降趨勢，且各試驗處理均顯著性高于CK；隨著稀釋倍數的增加菜豆葉片POD酶活性呈下降趨勢，其中T1和T2顯著高于CK和T5，在根部該酶活性以T3和T4最高，且顯著高于其他各處理，同時T1和T2亦顯著高于CK；

PAL活性在各試驗處理間差異不顯著，僅在菜豆根部T3顯著高于CK，其他各試驗處理雖均高于CK，但差異不顯著；在菜豆葉片內幾丁質酶的活性以CK最高，T2和T5次之，T1、T3和T4活性相對較低，其中CK顯著高于T1、T3和T4，在菜豆根部該酶的活性以CK和T5最高，T3和T4次之，T1和T2最低，CK顯著高于除T5外的各試驗處理(表2)。

表2 不同濃度6%寡糖·鏈蛋白浸種對菜豆抗性相關酶活的影響

2.4 對菜豆根腐病防控效果的影響

經不同濃度6%寡糖·鏈蛋白浸種處理后播種，出苗后15 d，各試驗處理組病情指數均顯著低于CK，同時亦表現出不同的防治效果。T1對菜豆根腐病的防治效果最佳，防治效果可達50%左右，T2次之，其他各試驗處理防治效果為30%左右，其中T1與除T2外的其他各處理均形成了顯著性差異，同時各試驗處理對菜豆根腐病的防效均顯著高于對照處理。

表3 不同濃度6%寡糖·鏈蛋白浸種對菜豆根腐病防控效果的影響

3 小結與討論

6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑—阿泰靈，自登記以來在水稻、西瓜、葡萄、茶葉等多種農作物及水果上均有應用報道，在抗病抗蟲方面均有較好的應用效果，但其在菜豆上的應用，以及作為種子處理劑的應用鮮有報道。本研究以20、80、200、500、1 000倍的6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑稀釋液浸泡菜豆種子，對出苗率、根系長度、葉綠素含量、根腐病防治效果、抗性相關酶活性等進行了分析比較，以期初步明確6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑作為種子處理劑在菜豆上的使用方法，及對根腐病的防控機理。

結果表明，各稀釋倍數的6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑浸泡菜豆種子，對菜豆根腐病均有顯著性防治效果，其中稀釋20倍對菜豆根腐病防控效果最佳，且顯著性優于其他各處理，其次為稀釋80倍和500倍，稀釋200倍和1 000倍效果相對一般，與CK相比防治效果均低于30%。但是，在對各稀釋倍數的6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑浸泡菜豆種子的出苗率進行統計分析后發現，6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑浸泡菜豆種子對種子發芽有一定抑制作用，并且稀釋20、80和200倍能夠顯著性降低菜豆的出苗率，這與張強等[7]在水稻上的試驗結果有一定差異，可能與本試驗采用浸種的6%寡糖·鏈蛋白濃度過高有關。為了進一步研究各稀釋倍數的6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑浸泡菜豆種子對菜豆幼苗可能造成的影響，本試驗同時對播種后9 d的菜豆幼苗葉綠素含量、根系活力等指標進行了統計分析。結果表明，各稀釋倍數的6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑浸泡菜豆種子對菜豆幼苗無明顯抑制作用。

PPO和POD是植物體內廣泛存在的抗性相關活性酶[14]，能增加植株幼嫩組織的木質化程度及醌類化合物形成，構成保護性屏障而使細胞免受病菌的侵害，也可以通過形成醌類物質直接發揮抗病作用。亦可通過催化作用，將植物細胞內多余的H2O2還原為H2O。作為苯丙烷類代謝中最為重要的代謝催化酶[15]，PAL可催化形成包括植保素、木質素和酚類化合物等抗病次生物質。β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶可以降解大多數真菌細胞壁[16-18]，阻止或中斷真菌在植物體內的侵染、定殖和擴展，在抗真菌病害的研究方面亦受到廣泛關注。本研究表明，不同稀釋倍數的6%寡糖·鏈蛋白浸種，對菜豆苗期葉片和根部的PPO和POD均有一定的誘導上調作用，這與盛世英等[5]在小麥上的研究以及李培玲等[19]在馬鈴薯上的研究相一致，而在PAL、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶3個抗性相關酶活性方面無明顯變化規律，這說明6%寡糖·鏈蛋白可通過激發PPO和POD 2個關鍵抗性相關酶活性，從而產生防御反應，這是誘導菜豆抗根腐病的重要機制之一。

綜上研究結果表明，6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑浸泡菜豆種子，能夠激發菜豆幼苗的抗病性，減少病害發生，保障菜豆健康生長，是菜豆安全生產中的綠色防控方法。在稀釋倍數方面，以500倍稀釋液浸種效果最佳，濃度過高會抑制菜豆種子的萌發，降低出苗率。在抗病機制方面，6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑可顯著提高菜豆中具有廣譜抗病功能的PPO和POD等抗性相關酶活性，能夠激發菜豆廣譜抗病性，不僅對根腐病具有較高防治效果，同時對其他病害亦有一定防控作用。