不同甜橙品種胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

歐陽歡， 熊遂金， 陳健美， 鐘八蓮

(贛南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000)

以柑橘黃龍病為代表的柑橘病害，對我國乃至全球柑橘產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展造成了嚴重的影響。目前，全球已發(fā)現(xiàn)80余種柑橘病毒類病害，而在我國已超過15種柑橘病毒及類病毒被報道[1-2]。胚性愈傷組織是利用柑橘珠心胚脫毒及原生質(zhì)體融合等生物技術(shù)育種的重要材料。柑橘珠心胚主要由珠心胚原基細胞發(fā)育而成，它們起源于珠心組織珠孔端的一兩層細胞內(nèi)，在珠孔到珠心的中間、胚囊邊緣第1層及鄰近珠被的珠心外表皮甚至合點端有時也偶爾存在珠心胚原基細胞，珠心胚原基細胞的細胞核大，細胞質(zhì)濃厚，明顯區(qū)別于其他細胞，并形成厚細胞壁將其與周圍珠心組織隔離開來[3]。病毒通常是經(jīng)過維管束的韌皮部傳播的，而珠心與維管系統(tǒng)無直接聯(lián)系，由珠心細胞誘導(dǎo)發(fā)生的植株可以免除病毒的危害[4]。但珠心胚大多是不育的，必須分離培養(yǎng)才能發(fā)育成正常的幼苗。Navarro等[5]用組織培養(yǎng)的方法，從單胚性的克里曼丁橘上培養(yǎng)出了無病毒的良種珠心苗。高峰等[6]對華盛頓臍橙的未受精胚珠進行離體培養(yǎng)獲得了脫去裂皮病和衰退病的無病毒珠心苗。對于具有多胚性的柑橘品種來說，珠心胚可取自種子中的非合子胚，但是對于單胚性或無籽的柑橘品種，珠心胚只能通過未受精胚珠進行離體組織培養(yǎng)來獲得。本研究是在組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，以贛南早臍橙、紐荷爾臍橙、哈姆林甜橙不同發(fā)育時期果實的未受精胚珠為外植體，通過比較不同取樣時間及誘導(dǎo)培養(yǎng)基下的未受精胚珠愈傷誘導(dǎo)率和胚性愈傷誘導(dǎo)率，以期建立一個高效的甜橙胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

贛南早臍橙、紐荷爾臍橙、哈姆林甜橙取自國家臍橙工程技術(shù)研究中心柑橘種質(zhì)資源圃。從2019年6月9日起至8月27日，每隔10 d取1次贛南早臍橙、紐荷爾臍橙和哈姆林甜橙的果實，共取樣9次。3個品種的花期在4月初左右，第1次采樣的時間記為花后65 d，之后取樣時間以此推算。

1.2 方法

將取回的柑橘果實用自來水清洗干凈表皮后，在超凈臺用75%乙醇表面消毒，無菌水清洗，將果實剖開，去掉果肉，可發(fā)現(xiàn)囊衣內(nèi)緊靠中柱處有許多未發(fā)育的小胚珠，長1～2.5 mm。用小鑷子將這些小胚珠輕輕挑下，放入預(yù)先配置好的5種培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基設(shè)置3個重復(fù)。培養(yǎng)材料30 d繼代1次，60 d后記錄數(shù)據(jù)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基是MT+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂，在此基礎(chǔ)上添加不同激素，配置成5種不同培養(yǎng)基(表1)。

表1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素配方

1.3 數(shù)據(jù)處理

出愈率=形成愈傷組織個數(shù)/外植體接種總數(shù)×100%。

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=形成胚性愈傷組織個數(shù)/外植體接種總數(shù)×100%。

數(shù)據(jù)整理及分析采用Microsoft Excel 2007軟件，作圖采用SigmaPlot 13軟件。

2 結(jié)果與分析

試驗獲得的甜橙愈傷組織分為胚性細胞和非胚性細胞2種，二者在細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)上有很大區(qū)別。柑橘的胚性和非胚性愈傷組織的外觀形態(tài)差異如圖1所示。柑橘的胚性愈傷組織是白色或乳白色的疏松的愈傷組織顆粒或愈傷團，能夠較快地增殖并能長期繼代保存；非胚性愈傷組織是米黃色的致密愈傷組織塊，幾乎不增殖，易于再生芽。非胚性愈傷組織不能繼代保存，而胚性愈傷組織能夠較快的增殖并能長期繼代保存。

A—剛接種未受精胚珠；B—誘導(dǎo)60 d獲得的非胚性愈傷組織；C—誘導(dǎo)60 d獲得的胚性愈傷組織；D—胚性愈傷組織經(jīng)分化培養(yǎng)30 d后的生長狀態(tài)。

2.1 贛南早臍橙誘導(dǎo)培養(yǎng)基及采樣時間的篩選

5種培養(yǎng)基對贛南早臍橙未成熟胚珠誘導(dǎo)成愈傷組織均有效，尤其是培養(yǎng)基E，其愈傷誘導(dǎo)率在88.74%～100%，誘導(dǎo)效果顯著。但是，培養(yǎng)基E對贛南早臍橙胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效果不佳，最高只有12.78%，即培養(yǎng)基E誘導(dǎo)的愈傷基本為非胚性愈傷組織。培養(yǎng)基A對贛南早臍橙未成熟胚珠的愈傷在115 d達到最好效果，為97.02%；其次在125 d為96.11%，最低出愈率是61.90%，但整個采樣時間胚性愈傷率都非常低，除了在早期65 d和75 d時有少量胚性愈傷被誘導(dǎo)，出愈率分別為7.41%和2.09%，其余時間取樣的胚性愈傷誘導(dǎo)率為0。培養(yǎng)基B誘導(dǎo)的胚性愈傷誘導(dǎo)率最高只有10.00%，即贛南早臍橙未成熟胚珠經(jīng)培養(yǎng)基B誘導(dǎo)的愈傷大部分為非胚性愈傷，只有少部分為胚性愈傷組織。贛南早臍橙未受精胚珠經(jīng)培養(yǎng)基C誘導(dǎo)后，其出愈率在75 d達到最大值，并在105 d開始下降，降至145 d的66.67%，同時培養(yǎng)基C誘導(dǎo)后的胚性愈傷率在整個采樣時期呈現(xiàn)先升后降趨勢，在95 d達到峰值為23.64%。而經(jīng)培養(yǎng)基D誘導(dǎo)后，贛南早臍橙未受精胚珠愈傷誘導(dǎo)率在85 d達到最高值為97.77%，從95 d開始下降，而胚性愈傷率在105 d達到最高值為35.90%(圖2)。綜上，培養(yǎng)基A和E對贛南早臍橙未受精胚珠愈傷誘導(dǎo)較好，但是胚性愈傷效果不顯著，要得到較多的贛南早臍橙胚性愈傷組織則應(yīng)使用培養(yǎng)基D，在105 d進行采樣。

圖2 贛南早臍橙在5種不同培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)組織情況

2.2 紐荷爾臍橙誘導(dǎo)培養(yǎng)基及采樣時間的篩選

紐荷爾臍橙未受精胚珠經(jīng)培養(yǎng)基A誘導(dǎo)的出愈率在105 d達到最大值81.98%，最小值為125 d的36.35%，但是其胚性愈傷率最高僅有1.85%，說明培養(yǎng)基A對于胚性愈傷的誘導(dǎo)效果不顯著。培養(yǎng)基B的出愈率在95 d之前保持在95.29%，從105 d開始下降，最低到達135 d的69.68%，同時經(jīng)培養(yǎng)基B誘導(dǎo)后的胚性愈傷率也在95 d達到最高值，為19.81%，且從105 d后開始下降，最低降至135 d的0.95%。紐荷爾臍橙未受精胚珠經(jīng)培養(yǎng)基C誘導(dǎo)后的出愈率在75 d和85 d達到最高值，均為100%，從105 d開始下降，在125 d達到最低值為70.00%；其胚性愈傷誘導(dǎo)率在95 d達到最大值56.21%，之后開始下降，即紐荷爾臍橙未受精胚珠經(jīng)培養(yǎng)基C誘導(dǎo)后，采樣時間為95 d的愈傷誘導(dǎo)率較高且胚性愈傷誘導(dǎo)率也最高。培養(yǎng)基D的愈傷誘導(dǎo)率在105 d以前保持在90.00%以上，105 d以后略有下降；而培養(yǎng)基D誘導(dǎo)的胚性愈傷率在95 d達到最高值32.51%，在75～95 d期間呈上升趨勢，95～145 d期間呈下降趨勢。培養(yǎng)基E對紐荷爾臍橙未受精胚珠的胚性愈傷誘導(dǎo)在整個采樣時期效果均不佳，但出愈率保持在92.57%以上(圖3)。綜上，紐荷爾臍橙未受精胚珠經(jīng)培養(yǎng)基A、E誘導(dǎo)后得到的愈傷基本為非胚性愈傷組織，且培養(yǎng)基E的誘導(dǎo)效果要優(yōu)于培養(yǎng)基A，而培養(yǎng)基B、C、D誘導(dǎo)的胚性出愈率在95 d采樣時間達到最大值，其中培養(yǎng)基C的誘導(dǎo)效果最顯著，即紐荷爾臍橙未受精胚珠在95 d采樣使用培養(yǎng)基C誘導(dǎo)效果最佳。

圖3 紐荷爾臍橙在5種不同培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)情況

2.3 哈姆林甜橙誘導(dǎo)培養(yǎng)基及采樣時間的篩選

哈姆林甜橙未受精胚珠經(jīng)培養(yǎng)基A誘導(dǎo)后的出愈率在85 d達到最大值73.86%，而胚性愈傷率則僅在125 d達到最高值5.87%，即培養(yǎng)基A誘導(dǎo)對胚性愈傷的效果不顯著。經(jīng)培養(yǎng)基B誘導(dǎo)后的出愈率在采樣前期保持在一個較高的水平，最低只有92.06%，在最后兩次采樣時開始呈下降趨勢，但胚性愈傷率在65～95 d呈上升趨勢，在95 d達到最高27.78%。培養(yǎng)基C的愈傷誘導(dǎo)效果顯著，胚性愈傷率在65～95 d呈上升趨勢，且在95 d達到最高值65.08%，95 d至采樣結(jié)束呈下降趨勢，在135 d達到最低值2.86%。對培養(yǎng)基D來說，哈姆林甜橙的出愈率在65～105 d呈下降趨勢，在105 d達到最低值77.43%，從115 d開始上升至采樣結(jié)束。同時培養(yǎng)基D對哈姆林甜橙未受精胚珠不同生長時期胚珠胚性愈傷組織的誘導(dǎo)在65～105 d呈上升趨勢，在105 d達到最高值，為59.13%，105～145 d呈下降趨勢。培養(yǎng)基E在75～105 d和125～135 d的誘導(dǎo)效果顯著，這說明這兩個時間段培養(yǎng)基E對哈姆林甜橙未受精胚珠有很好的愈傷誘導(dǎo)效果，但是對哈姆林甜橙各個時期的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效果不佳(圖4)。綜上，培養(yǎng)基A、E用于哈姆林甜橙未受精胚珠愈傷的誘導(dǎo)中，非胚性愈傷誘導(dǎo)效果顯著。培養(yǎng)基B、C、D對哈姆林甜橙未受精胚珠胚性愈傷組織誘導(dǎo)效果有差異，培養(yǎng)基C、D的誘導(dǎo)效果要優(yōu)于培養(yǎng)基B，若使用培養(yǎng)基C，則最佳采樣時間為95 d，若使用培養(yǎng)基D，最佳采樣時間為105 d。

圖4 哈姆林甜橙在5種不同培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)情況

3 小結(jié)與結(jié)論

激素是組培中誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵因子之一，本研究用未加激素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)3個柑橘品種未受精胚珠的愈傷誘導(dǎo)效率較低，且不能獲得胚性愈傷組織。6-BA對柑橘胚性愈傷的誘導(dǎo)有顯著效果，培養(yǎng)基B、C、D中，隨著6-BA的濃度逐漸升高，愈傷誘導(dǎo)效率在逐漸升高，但是培養(yǎng)基C、D之間效果相當(dāng)，相差不大。Starrantino等[7]誘導(dǎo)甜橙胚性愈傷組織時發(fā)現(xiàn)，隨著細胞分裂素的增加，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率也隨之提高，認為這可能與成熟種子中ABA含量較高有關(guān)，因為種子中高濃度ABA需要赤霉素或高濃度的細胞分裂素與之相拮抗才能形成胚性愈傷組織。贛南早臍橙為紐荷爾臍橙芽變早熟品種，比目前主栽品種紐荷爾臍橙早熟30 d以上[8]，所以在相同采樣時期贛南早臍橙比紐荷爾臍橙和哈姆林甜橙成熟度更高，且贛南早臍橙果實ABA含量出現(xiàn)峰值的時間早于紐荷爾臍橙，在115 d之前其ABA含量高于紐荷爾臍橙[9]，這可能就解釋了為什么贛南早臍橙胚性愈傷誘導(dǎo)的6-BA最適濃度為7.50 mg·L-1，而紐荷爾臍橙為5 mg·L-1，且在相同的培養(yǎng)基和采樣時期下哈姆林甜橙的最高胚性愈傷誘導(dǎo)率比贛南早臍橙高的原因。在禾本科植物胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程中，2,4-D是很有效的激素，但是2,4-D誘導(dǎo)下3個柑橘品種的愈傷為非胚性的致密型愈傷組織，說明2,4-D在柑橘愈傷組織誘導(dǎo)中更利于致密的、非胚性的愈傷組織的形成，且Vardi等[10]認為，2,4-D還會導(dǎo)致愈傷組織染色體的變異。

一般來說幼嫩的胚珠比老的胚珠較容易誘導(dǎo)胚性愈傷組織，多胚品種比單胚品種誘導(dǎo)更為容易[11]，贛南早臍橙、紐荷爾臍橙、哈姆林甜橙都屬于多胚品種。史文靜等[12]發(fā)現(xiàn)，葡萄的胚珠離體培養(yǎng)時間在花后5～8周可以得到較好的效果。本研究3個品種在采樣后期的愈傷誘導(dǎo)效果都不如采樣中期，且最佳胚性愈傷誘導(dǎo)效果都集中在采樣中期。

胚珠是體細胞再生的理想材料，為難以獲得種子的植物提供育種新思路，王榮梅[13]以未受精胚珠為外植體對萱草科植物離體雌核進行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)效果差異顯著，誘導(dǎo)效果最佳可達66.67%。劉寶勇[14]在使用朱頂紅的子房進行培養(yǎng)時獲得了大量由胚珠發(fā)育而成的無菌苗。本研究通過甜橙未受精胚珠獲得了大量的愈傷組織，為柑橘植株再生提供材料。研究篩選出了贛南早臍橙、紐荷爾臍橙、哈姆林甜橙未成熟胚珠的最佳愈傷誘導(dǎo)方案，其中贛南早臍橙使用培養(yǎng)基MT+7.50 mg·L-16-BA，在105 d進行采樣；紐荷爾臍橙使用培養(yǎng)基MT+5.0 mg·L-16-BA且在95 d采樣；哈姆林甜橙使用培養(yǎng)基MT+5.0 mg·L-16-BA在95 d采樣，若使用培養(yǎng)基MT+7.50 mg·L-16-BA，則最佳采樣時間為105 d。本研究建立了一個高效的甜橙胚性愈傷誘導(dǎo)體系，為進一步研究贛南早臍橙、紐荷爾臍橙、哈姆林甜橙未受精胚珠組織培養(yǎng)、脫毒保存及通過生物技術(shù)手段改良臍橙品種奠定基礎(chǔ)。