葉綠素傳感器海上應用影響因素研究進展

廖丹寧 , 鄭旻輝 , 潘建明 , 楊俊毅, 林燈科

(1. 自然資源部 海洋生態系統動力學重點實驗室, 浙江 杭州 310012; 2. 自然資源部 第二海洋研究所, 浙江 杭州 310012; 3. 杭州電子科技大學 機械工程學院, 浙江 杭州 310018)

浮游植物是海洋環境中初級生產力的重要組成部分, 在海洋生態系統中扮演著極為重要的角色。葉綠素濃度是衡量浮游植物豐度的重要指標[1], 通過測量葉綠素含量可獲知水體中初級生產力情況和水質的富營養化程度[2], 因此葉綠素含量指標在海洋水質環境監測、赤潮監測預報等方面有著廣泛應用。此外, 研究海洋葉綠素和初級生產力情況, 還有助于了解海洋中碳的生物地球化學循環和氣候變化,對全球海洋碳循環研究具有重要意義[3]。由此可見,快速準確地測定海水中的葉綠素含量, 對于業務化監測和科學研究都具有重要的現實意義。

測定葉綠素的常用方法有分光光度法、熒光萃取法、高效液相色譜法、熒光傳感器法、衛星遙感法等。分光光度法、熒光萃取法、高效液相色譜法都屬于實驗室常規方法, 具有精確度高等優點[4-5],但該類方法必須經過水樣采集和樣品處理, 操作步驟繁雜、時間冗長, 使得獲得的葉綠素數據在時空上不連續[6]。遙感法具有綜合、客觀、便捷的特點, 適用于大面積水體的長期動態監測, 但遙感法測定過程較為復雜且易受天氣等因素影響, 數據準確性仍較低[7]。與上述幾種方法相比, 基于活體熒光法的葉綠素傳感器操作簡便, 可長期原位在線監測, 能輕易獲取大批量實測數據, 是海水葉綠素高精度測量手段的主要發展趨勢。

活體熒光法葉綠素傳感器的研制最早可追溯到20世紀60年代[8]。經過數十年的持續發展, 目前國際上已有多款商業化產品, 在海洋領域使用較多的包括Turner C3、WETLabs ECO FL、Seapoint SCF等。由于優異的海洋原位探測能力, 近年來葉綠素傳感器已被廣泛應用于赤潮藻類消亡過程、浮游植物生物量及群落組成, 以及水體垂直剖面和水下運動平臺觀測等科研活動[5-8]。但葉綠素傳感器在實際應用中還存在一些問題, 主要體現在傳感器數據與實驗室萃取法數值之間存在較大偏差且應用于不同水體時偏差不固定[9-10]。葉綠素傳感器在海上應用時會受到海洋中多種環境因素的影響, 科學界此前已在濁度、溫度、光照、鹽度及藻種差異等因素影響方面開展了一些研究, 并基于獲取的影響規律嘗試對葉綠素傳感器測值進行數據校正。表1列舉了當前科學界在葉綠素傳感器測量影響因素方面的主要研究成果。

表1 葉綠素傳感器測量影響因素研究概況Tab. 1 Outline of factors affecting chlorophyll sensors measurement

1 濁度影響研究

1.1 濁度影響規律

懸浮顆粒物對葉綠素傳感器的影響幾乎困擾著傳感器應用的全過程, 因此科學家關于懸浮顆粒物對葉綠素傳感器測量的影響研究由來已久。海水的懸浮顆粒物一般由懸浮顆粒物濃度和濁度兩個參數表征。濁度主要反映水中懸浮物對光線通過時所產生的阻礙程度, 因此更適用于基于光學檢測的葉綠素傳感器影響研究。早在1980年, 丁永耀等[4]指出: 當水體較渾濁時, 會使葉綠素a的熒光測定結果偏高, 此后王巖峰等[11]的研究結果證實了這一結論。而后, 不斷有學者通過實驗室藻類培養實驗和現場水體環境實測, 驗證了濁度對葉綠素傳感器測量的影響[12-14]。

大部分學者認為當水體較渾濁時會使葉綠素a的熒光測定結果偏高, 并且部分研究認為在一定濁度范圍內, 濁度引起的葉綠素增量與濁度呈顯著正相關[4,11,13,15-16]。但也存在一些關于懸浮顆粒物使得葉綠素傳感器測值偏低的研究報道[17-19]。鄭旻輝[3]通過在清水和藻液中加入福爾馬肼濁度標準液較系統地研究了濁度對葉綠素傳感器測量的影響, 發現在沒有藻液情況下高濁度也會產生葉綠素熒光信號,在藻液濃度較低時高濁度會使傳感器測量值偏高,藻液濃度較高時則正好相反。可見, 當前科學界尚未完整掌握懸浮顆粒物對葉綠素傳感器測量的影響規律。

1.2 濁度影響機理

目前關于懸浮顆粒物對葉綠素傳感器的影響機理, 科學界仍存在一定分歧。總體來說, 懸浮顆粒物對葉綠素傳感器測量的影響主要包括散射作用、反射作用、熒光效用和遮蔽效應等4種解釋(圖1)。

圖1 懸浮顆粒物(SPM)對葉綠素傳感器測量的影響示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the influence of suspended particulate matter (SPM) on chlorophyll sensor measurement

通常來說, 學者們對于懸浮顆粒物影響機理的解釋都是圍繞各自觀察到的實驗現象展開。在解釋濁度引起的葉綠素測值增大現象時, 多數學者認為懸浮顆粒物的影響主要在于對傳感器檢測光的散射作用, 放大了藻細胞接收到的激發光強度, 同時放大了傳感器接收到的發射光強度, 從而共同引起傳感器測量結果偏高[13,15,16]。也有學者認為實際海洋水體中存在的葉綠素降解產物碎屑及有色溶解有機物(CDOM)等物質的存在, 是導致葉綠素測值偏高的主要原因[20-22]。

與此相反的是, 觀察到懸浮顆粒物使得葉綠素傳感器測值偏低現象的學者則認為水中粒子的存在會阻礙傳感器檢測窗口與藻類細胞間的光線傳輸,從而降低傳感器信號值[17-18]。而針對實驗中發現的懸浮顆粒物多重影響現象, 鄭旻輝[3]認為某些懸浮顆粒物本身具有熒光性, 從而推測除了具有反射和散射作用外, 懸浮顆粒物對葉綠素傳感器的測量可能還存在“熒光效應”和“遮蔽效應”影響。

需要指出的是, 當前研究結果多為基于有限的實驗室模擬結果和現場觀測數據所得的表面規律進行的推測分析, 各觀點都存在一定局限性,后續仍需進一步開展機理層面的深入分析和嚴謹驗證。

1.3 濁度影響校正方法

在懸浮顆粒物對葉綠素傳感器測量影響研究過程中, 多位學者試圖獲取葉綠素傳感器的數據校準公式。基于葉綠素增量與濁度呈顯著正相關的認識的學者們一般都采用線性校準公式, 但不同學者給出的校準系數存在較大差異, 濁度影響修正系數在0.006 7～0.017 4[12,15]。該類研究主要基于實驗室內簡單的藻類培養模擬實驗, 獲得的校準公式大多未進行大量重復驗證, 也未在實際水體環境進行驗證。

在鄭旻輝提出懸浮顆粒物的熒光效應和遮蔽效應對葉綠素傳感器測量影響的基礎上, 葉陳軍[23]等通過進一步的研究確認了近海表層沉積物也能適用“熒光效應”和“遮蔽效應”推測, 并嘗試建立了一種葉綠素傳感器數據的濁度影響校正方法。該方法通過表層沉積物模擬實驗分別獲取熒光效應系數和遮蔽效應系數(共同構成葉綠素傳感器濁度影響校準系數), 在實際應用中將葉綠素和濁度傳感器同步數據代入校準公式即可進行現場實時校正。葉陳軍等使用該方法在象山港進行了海上現場驗證并取得較好效果(圖2), 表明基于該推測的濁度影響校正方法具有一定的實踐意義。

圖2 葉綠素傳感器濁度影響校正方法海上驗證結果Fig. 2 Verification results of turbidity effect correction method of chlorophyll sensor at sea

不同學者對于懸浮顆粒物對葉綠素傳感器影響機理的理解各不相同, 給出的校準系數存在較大差異。由于各自采用的傳感器品牌和型號, 以及選用藻種、懸浮顆粒物類型、濃度范圍等實驗條件并不完全一致, 現有研究難以有效區分傳感器自身結構設計和校準實驗方法對校準系數差異的貢獻程度。多數公式雖然針對當次實驗數據有較好的校正效果,但并未在不同海區實際水體環境得到充分驗證, 其方法在多大時空范圍內能夠適用依然未知。目前尚未有能在不同海區廣泛適用并被業界普遍認可葉綠素傳感器濁度影響校準方法。

2 光照影響研究

2.1 光照影響規律

海洋水體中的光照與天氣狀況息息相關, 所以光照強度時刻存在波動; 而且對于生活在不同深度的浮游植物, 其接收到的光照強度也會有較大差異。光照會影響葉綠素的合成, 所以不同的光照條件下葉綠素傳感器的測定值也會有很大不同。許多學者通過實驗研究發現, 通常在弱光條件下藻類的色素含量更高, 即葉綠素傳感器的測定值會較高; 而在過強光照下, 傳感器的測定值會偏低[24-25]。除此之外, 鄭旻輝[3]通過短期和長期光照變化實驗, 發現不同程度的光照變化均會對硅藻葉綠素活體熒光造成影響: 不同光暗比下, 光照所占比例越大, 越有利于提高硅藻葉綠素活體熒光水平; 光照突變瞬間硅藻葉綠素活體熒光會隨之出現明顯變化, 但當光照恢復穩定后, 硅藻葉綠素活體熒光也會回到突變前的水平。

2.2 光照影響機理

在光照對葉綠素傳感器測定影響的機理方面,學者們有許多種解釋。對于光照強度變化影響葉綠素傳感器測定的原因, 大部分學者認為, 因為弱光環境下藻類細胞會聚集光合作用色素以促進它們捕捉更多的光; 而過強光照下, 光合作用色素會減少來防止更多的能量激發和細胞損傷, 所以弱光條件下色素的含量更高。在實際應用中, 處于水體表面的浮游生物葉綠素熒光測定值較底棲浮游植物高[24-25]。而對于強光使葉綠素傳感器的測定值偏低的原因, 部分學者認為還有其他的解釋,即強光下發生非化學熒光猝滅, 導致色素熒光降低。熒光淬滅(fluorescence quenching)是指熒光物質分子與溶劑分子之間所發生的導致熒光強度變化或相關的激發峰位變化或熒光峰位變化物理或化學作用過程, 有化學熒光猝滅和非化學熒光猝滅兩種類型, 非化學熒光猝滅一般表示光量子產率的降低[26-27]。

由于光照對浮游植物熒光的影響機理很復雜,在改變環境條件時得到的實驗結果也會有較大變化,很難總結其中的變化規律, 目前科學界尚未有學者探究出關于光照對葉綠素熒光傳感器的可重復實驗驗證的校正公式。另一方面, 自然界中光照變化情況很復雜, 既有受季節影響的晝夜交替引起的光照時長變化, 也有移動云朵遮蔽導致的短時光照強度變化, 用何種方式指征自然界的光照變化自身也是一個需要探究的課題。

3 溫鹽影響研究

3.1 溫鹽影響規律

海洋水體的溫度和鹽度變化是一個較為緩慢的過程, 其對葉綠素傳感器測值的直接影響難以被輕易捕捉到。由于藻類自身長期生長受到多種影響因素的制約, 難以開展溫鹽單因子影響實驗研究, 長期溫度變化對葉綠素傳感器的影響尚未見諸報道。當前關于溫度和鹽度對葉綠素傳感器的影響研究多基于在實驗室開展的溫鹽短期快速變化下葉綠素傳感器的響應實驗。

大多數學者的研究結果顯示溫度短期快速變化對葉綠素傳感器測值無顯著影響[15]。也有部分學者認為溫度升高會引起葉綠素傳感器測值輕微降低[13,19,28]。基于藻類培養實驗的研究顯示, 短期鹽度快速變化對葉綠素傳感器測量的影響很小,可忽略不計[3,6]。

3.2 溫鹽影響機理

通過此前關于溫度對葉綠素a標準品及萃取樣品保存和測定影響的研究, 人們已經認識到溫度升高會提高葉綠素a的降解率, 造成測定結果偏低[30], 關于溫度對熒光法測定活體藻中葉綠素a影響的研究則相對較少。當前科學界關于溫度對葉綠素傳感器可能的影響分析主要包括: (1) 由于溫度升高提高了分子動能, 促進了分子間流動, 使液體動力增加粘度減小,增大了熒光分子和溶劑分子的碰撞機會, 熒光物質分子通過其他分子的碰撞造成內部能量的轉移, 從而導致溫度淬滅, 降低了熒光物質的熒光強度[28,30,31]。(2) 度的升高使部分葉綠素a降解生成了以脫鎂葉綠素a為主的降解產物, 兩者熒光特性有所差異, 從而降低了葉綠素a的熒光量子產率; (3) 低溫會減弱細胞活性, 降低光量子的吸收和熒光物質的發射;高溫則會抑制細胞活性, 促進熒光分子與溶劑分子的擴散和能量轉移[6]。但有學者認為, 因為浮游植物的種類不同, 所以隨著水溫的增加, 葉綠素熒光強度的降幅無法一以概之[25]。

4 藻類生理因素影響研究

4.1 藻種差異影響規律

已有多位學者通過實驗證實了不同藻類的活體熒光強度具有顯著差異。謝尚微[6]的研究結果顯示,在相同葉綠素a濃度的水體中, 中肋骨條藻、球等邊金藻和赤潮異彎藻等不同藻類的活體熒光存在顯著差異, 即不同藻類的葉綠素活體熒光值與萃取法葉綠素a濃度值之間的比值具有很大不同, 推測是由于不同種類浮游植物的葉綠體的數量、形態和位置不同導致的。Chang等[32]學者培養觀察了3種不同的藍藻在其生長過程中的藻密度和藻藍蛋白濃度的變化情況。結果顯示, 不同藻類的細胞密度隨時間變化關系大致相同, 但不同生長階段中各藻類的相對熒光單位(relative fluorescent unit, RFU)卻有較大差異(圖3), 表明藻種之間存在活體熒光差異[29,32]。

圖3 不同生長階段藻類活體熒光與細胞密度變化差異Fig. 3 Difference of fluorescence and cell density of algae in different growth stages

4.2 藻類生理特性影響規律

此外, 還有學者指出, 藻類自身的某些生理特性也會影響葉綠素活體熒光的測量。菌落形態和分子凝聚會影響藻細胞相對于傳感器的位置, 對測定結果造成影響。對藍藻的熒光值研究表明, 藍藻菌落發射出的熒光低于單個的藍藻細胞發出的熒光總和,這是熒光傳感器的激發光束無法穿透整個菌落和光散射造成的[33]。有研究表明, 含有不同藻膽素的浮游植物是藻類熒光測量過程中偏差的來源[34]。藻膽素(phycobilin)是藻類主要的光合色素, 僅存在于紅藻和藍藻中, 常與蛋白質結合為藻膽蛋白, 藻膽素的存在會干擾色素測定。

5 研究展望

本文總結了活體熒光法葉綠素傳感器在海洋水體環境測量時的影響因素研究現狀, 明確各海洋環境因素對葉綠素傳感器測量的影響機理是進行相關影響校正的前提。總體而言, 雖然目前科學界已經在濁度、光照、溫鹽和藻類生理因素等方面開展了一些研究, 基本明確了上述因素對葉綠素傳感器測量存在不同影響, 并基于少量實驗室模擬結果和現場數據獲取了一些影響校準公式, 但對于各因素完整的影響程度、影響機理, 以及相應的數據校正方法等方面研究都還存在很大不足, 導致目前仍然缺乏行之有效的葉綠素傳感器數據質量保障方法。

著眼于海洋日常監測與科學研究對于葉綠素傳感器數據的實際需求, 結合當前葉綠素傳感器海上應用中存在的具體問題和研究進展, 今后圍繞葉綠素傳感器的數據質量保障方法可采取以下研究思路:

1) 基于影響機理上的本質差異, 在葉綠素傳感器影響因素研究過程中, 對于藻類活體熒光強度影響和傳感器熒光值測定影響兩個方面應予以區分。考慮到海洋實際環境的復雜性, 在進行室內模擬實驗時, 實驗條件的設置應盡可能貼近于海洋實際環境。

2) 懸浮顆粒物影響方面當前已經取得較多研究結果, 并且已經初步建立了濁度影響校正方法。后續應重點開展影響機理研究, 探究粒度、組分等懸浮顆粒物特性中起決定性的因素, 明確海區懸浮顆粒物差異對于葉綠素傳感器測量的影響情況, 針對不同型號傳感器進行對比試驗, 建立起一種能夠廣泛適用的濁度影響校正方法并開展大量的海上實測驗證。

3) 現階段光照、溫鹽、藻種等影響方面仍將以開展室內模擬實驗為主要方式, 在逐步掌握可通過實驗重現的各因素影響規律基礎上, 結合海上各因素實際變化情況, 選擇具備較高自動化程度的表征手段, 開展進一步數據校正方法研究。