microRNA-34a/沉默信息調(diào)節(jié)因子1通路參與新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)生

林 妍，朱 慧

壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis, NEC)是一種新生兒時期常見的腸道炎性疾病，病死率高達23%～30%，嚴(yán)重威脅新生兒生命。但目前NEC的發(fā)病機制仍未完全明了，治療手段也有限，若病情進入進展期，則預(yù)后較差，25%經(jīng)手術(shù)治療的患兒存在胃腸道長期后遺癥[1]。故亟待探討NEC的相關(guān)發(fā)病機制及影響因素以提升臨床診療效果。

microRNA(miRNA)是一類含有19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，在人類或大鼠、小鼠等動物體內(nèi)穩(wěn)定表達，可調(diào)控相應(yīng)的靶基因，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展，已被證實是多種疾病的重要生物檢測標(biāo)志[2-3]。研究證實，miR-222、miR-223、miR-451a、miR-27a、miR-187等與NEC的關(guān)系密切[4-6]，提示miR可能參與NEC發(fā)病的調(diào)控。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的脫乙酰化酶，可抑制炎癥反應(yīng)、參與細胞周期調(diào)控、抑制細胞凋亡[7]。研究表明，SIRT1參與了NEC的發(fā)病過程，且在NEC中呈低表達狀態(tài)[8-11]。已證實SIRT1是miR-34a的靶向位點之一[12-14]，該通路與多種疾病的發(fā)生相關(guān)[15-17]。因此，SIRT1是否由miR-34a調(diào)控而參與NEC的發(fā)病，該通路的具體作用機制是什么，需進一步探究。本研究以新生SD大鼠為研究對象，構(gòu)建NEC動物模型，旨在探究miR-34a、SIRT1與NEC的關(guān)系，為闡明NEC的發(fā)病機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組 出生2 h內(nèi)未開奶的無特定病原體的新生SD大鼠40只，雌雄不限，體質(zhì)量5.6～8.5 g[上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK(滬)2017-0005]。隨機分為5組，對照組(A組)8只，實驗組32只(又分為4組，分別為B～E組，其中B組為NEC模型組，C組為NEC模型+miR-34a干擾片段組，D組為NEC模型+SIRT1激動劑組，E組為NEC模型+miR-34a干擾片段+SIRT1抑制劑組，n=8)。A組：與代母鼠同籠鼠乳喂養(yǎng)。B～E組參照既往文獻并適當(dāng)改良建立NEC模型[18]，將大鼠放入連接氮氣的玻璃瓶中，待氮氣充滿瓶子60 s后取出大鼠，立即放于4 ℃下冷刺激10 min，2次/d,連續(xù)3 d。C～E組給予相應(yīng)藥物溶于生理鹽水后進行尾靜脈注射，A～B組給予等體積生理鹽水尾靜脈注射，1次/d，連續(xù)5 d。當(dāng)出現(xiàn)明顯臨床癥狀(如嚴(yán)重腹脹、血便和紫紺)時或于建模后第6天行頸椎脫臼處死大鼠，觀察各組大鼠的一般情況，根據(jù)實驗需求取腸管及血液標(biāo)本進行研究。

1.1.2 主要試劑及儀器 SIRT1激動劑(SRT 1720 Hydrochloride)及SIRT1抑制劑(Nicotinamide)(廣州柏賽柯生物技術(shù)有限公司)；miR-34a干擾片段(miR-34a inhibitors)(重慶市尚亞生物有限公司)。實時熒光定量PCR儀(Roche480，瑞士Roche公司)；凝膠成像系統(tǒng)(JS-2012，上海培清科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 腸組織病理學(xué)檢查方法 大鼠處死后，取回腸遠端5 cm腸管，用冷生理鹽水沖洗并清除腸內(nèi)容物后，置于10%中性福爾馬林固定24～48 h，脫水、包埋、連續(xù)切片(4～5 μm)、蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，H-E)染色、中性樹膠封固。病理評分參考文獻中的計分標(biāo)準(zhǔn)[19]：0分，腸黏膜絨毛完整，組織結(jié)構(gòu)正常；1分，輕度黏膜肌層和(或)黏膜下層與固有層分離；2分，中度黏膜肌層和(或)黏膜下層與固有層分離，黏膜下層或肌層水腫；3分，重度黏膜肌層和(或)黏膜下層與固有層分離，黏膜下層或肌層水腫，局部絨毛脫落；4分，腸黏膜絨毛消失伴腸壞死。雙盲法計分，病理評分≥2分者視為發(fā)生NEC。

1.2.2 腸組織miR-34α、SIRT1的mRNA表達測定 采取實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR)進行檢測。取各組凍存的腸組織標(biāo)本，加入NucleoZol試劑提取總RNA，其中miR-34α需加入miR-34a頸環(huán)結(jié)構(gòu)(反轉(zhuǎn)錄引物)以延長序列。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。分別以U6、GAPDH為內(nèi)參，將cDNA稀釋后加入引物，配成體系行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s→60 ℃退火30 s→72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后采用ΔΔCt方法對各組目的基因進行相對定量分析。相關(guān)引物由重慶市尚亞生物有限公司設(shè)計合成。

miR-34a：

上游：5′-CGCGTGGCAGTGTCTTAGCT-3′

下游：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′

反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAACC-3′

內(nèi)參U6：

上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′

下游：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′

SIRT1：

上游：5′-GCTGTGGACTTCCCGGATCT-3′

下游：5′-AACAGAGCTGCTCATGAATGC-3′

內(nèi)參GAPDH：

上游：5′-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3′

下游：5′-GGTAACCAGGCGTCCGATAC-3′

1.2.3 腸管組織中SIRT1、炎癥細胞因子的蛋白表達測定 采用免疫印跡實驗(Western-blot)檢測SIRT1以及包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-10在內(nèi)的炎癥細胞因子的蛋白量。加入含PMSF的蛋白裂解液，提取總蛋白，用BCA蛋白測定法檢測各個樣品總蛋白濃度，經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)印、封閉后，將膜放入裝有稀釋的鼠一抗的雜交盒中(其中IL-1β的一抗按1∶10 000稀釋，余實驗中的一抗按1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，再放入1∶5 000稀釋的鼠二抗雜交盒中，室溫孵育2 h，采用凝膠成像系統(tǒng)檢測發(fā)光，收集條帶圖像，以β-actin為內(nèi)參，分析條帶灰度值。

1.2.4 血清中炎癥細胞因子及氧化應(yīng)激因子的濃度測定 采用ELISA對炎癥細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10)，以及包括單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)在內(nèi)的氧化應(yīng)激因子進行濃度測定。抽取各組大鼠靜脈血2 mL，3 500 r/min離心后吸取上清，置于-20 ℃冰箱保存，再根據(jù)各個試劑盒的說明書進行濃度測定。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況與生長發(fā)育 實驗組大鼠24 h內(nèi)均存活，48 h內(nèi)存活29只(90.6%)，72 h內(nèi)存活 25只(78.1%)，對照組均存活。對照組大鼠進食及活動正常，大便性狀正常，對刺激反應(yīng)良好。實驗組大鼠在建模過程中均出現(xiàn)不同程度的進食量下降、活動減少、腹部膨隆、排便異常等表現(xiàn)。

2.2 NEC模型建設(shè)情況及腸管組織H-E染色結(jié)果 各組H-E染色結(jié)果顯示：A組腸黏膜絨毛完整，組織結(jié)構(gòu)大致正常，病理評分(0.25±0.46)分。B組大量腸黏膜絨毛脫落、消失，重度黏膜肌層和黏膜下層與固有層分離，間質(zhì)崩解，損傷最嚴(yán)重，病理評分(3.88±0.35)分，顯著高于A組(P<0.001)。C、D組病理評分均為(2.25±0.46)分，較B組降低(P<0.001)，可見輕中度黏膜肌層和(或)黏膜下層與固有層分離，組織損傷均較B組減輕；E組病理評分(3.13±0.35)分，較 C組高(P<0.001)，部分腸黏膜絨毛脫落，中重度黏膜肌層和黏膜下層與固有層分離，組織損傷較C組更嚴(yán)重(圖1)。

A：A組(對照組)，腸黏膜絨毛完整，組織結(jié)構(gòu)大致正常；B：B組(NEC模型組)，腸黏膜絨毛脫落、消失，重度黏膜肌層和黏膜下層與固有層分離；C：C組(NEC模型+miR-34a干擾片段組)，輕中度黏膜肌層和(或)黏膜下層與固有層分離；D：D組(NEC模型+SIRT1激動劑組)，輕中度黏膜肌層和(或)黏膜下層與固有層分離；E：E組(NEC模型+miR-34a干擾片段+SIRT1抑制劑組)，腸黏膜絨毛脫落，中重度黏膜肌層和黏膜下層與固有層分離。

2.3 腸管組織中miR-34a、SIRT1的mRNA相對表達情況 與A組比較，B組中的miR-34a表達增加(P<0.001)、SIRT1 mRNA表達減少(P<0.001)；C、D組分別與B組比較顯示，使用miR-34a干擾片段或SIRT1激動劑后均可使miR-34a的表達顯著減少(P<0.001)，SIRT1 mRNA的表達明顯增加(P<0.05)；E組與C組比較顯示，使用SIRT1抑制劑后SIRT1 mRNA的表達相對減少(P<0.05)，miR-34a的表達相對增加(P<0.01，圖2)。

miR-34a：microRNA-34a；SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)因子1。A組：對照組；B組：NEC模型組；C組：NEC模型+miR-34a干擾片段組；D組：NEC模型+SIRT1激動劑組；E組：NEC模型+miR-34a干擾片段+SIRT1抑制劑組。A：miR-34a；B：SIRT1 mRNA。☆：P<0.05，☆☆：P<0.01，☆☆☆：P<0.001。

2.4 腸管組織中SIRT1、炎癥細胞因子的蛋白表達情況 腸管組織中SIRT1的蛋白表達情況與其mRNA的表達意義一致，且差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。B組的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8蛋白水平較A組顯著增加(P<0.001)，而IL-10蛋白水平較A組降低(P<0.001)；C、D組分別與B組比較顯示，使用miR-34a干擾片段或SIRT1激動劑后均可使TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8蛋白水平降低(P<0.05)，而IL-10蛋白水平增加(P<0.01)；E組與C組比較顯示，使用SIRT1抑制劑可使TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8蛋白水平增加(P<0.05)，而IL-10蛋白水平降低(P<0.01，圖3)。

SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)因子1；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細胞介素；β-actin：β-肌動蛋白(內(nèi)參)。A組：對照組；B組：NEC模型組；C組：NEC模型+miR-34a干擾片段組；D組：NEC模型+SIRT1激動劑組；E組：NEC模型+miR-34a干擾片段+SIRT1抑制劑組。A：SIRT1蛋白；B：TNF-α蛋白；C：IL-1β蛋白；D：IL-6蛋白；E：IL-8蛋白；F：IL-10蛋白；G：各組Western-blot檢測結(jié)果比較。☆☆：P<0.01，☆☆☆：P<0.001。

2.5 血清中炎癥細胞因子及氧化應(yīng)激相關(guān)因子的表達情況 血清中炎癥細胞因子的表達情況與其在腸組織中蛋白的表達意義一致，且差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。B組的MDA、MCP-1、VCAM-1濃度最高，SOD濃度最低。與A組比較，B組的MDA、MCP-1、VCAM-1濃度升高(P<0.05)，SOD濃度降低(P<0.001)；C、D組分別與B組比較顯示，使用miR-34a干擾片段或SIRT1激動劑后，MDA、MCP-1、VCAM-1濃度降低(P<0.05)，SOD濃度升高(P<0.01)；E組與C組比較顯示，使用SIRT1抑制劑后，血清中MDA、MCP-1、VCAM-1的濃度升高(P<0.05)，SOD濃度降低(P<0.05，圖4)。

IL：白細胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；MCP-1：單核細胞趨化蛋白-1；VCAM-1：血管細胞黏附分子-1；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。A組：對照組；B組：NEC模型組；C組：NEC模型+miR-34a干擾片段組；D組：NEC模型+SIRT1激動劑組；E組：NEC模型+miR-34a干擾片段+SIRT1抑制劑組。A、B：炎癥細胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10)的濃度；C、D：氧化應(yīng)激因子(MCP-1、VCAM-1、SOD、MDA)的濃度。☆：P<0.05，☆☆：P<0.01，☆☆☆：P<0.001。

3 討 論

目前，大部分研究認為，NEC的發(fā)病是由多種因素綜合作用所致，其中炎癥反應(yīng)被認為是關(guān)鍵因素[1]。本研究從炎癥反應(yīng)的角度出發(fā)，選取TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MDA、MCP-1等已被證實與腸道炎性疾病關(guān)系密切的炎性介質(zhì)作為NEC炎癥程度的觀測指標(biāo)[8,20-22]，探討NEC的發(fā)病機制。研究發(fā)現(xiàn)，參與癌癥及多種疾病調(diào)控的信號通路miR-34a/SIRT1也可影響炎癥介質(zhì)的釋放，與NEC的發(fā)病關(guān)系密切[15-17]。

本研究中的實驗組在建模過程中出現(xiàn)了不同程度的食量下降、活動減少、排便異常等表現(xiàn)，模型組的腸道標(biāo)本病理評分為(3.88±0.35)分，提示大鼠NEC模型造模成功，所檢測的各種指標(biāo)有代表意義。

SIRT1屬于Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，可在大鼠及人體的各細胞、組織中穩(wěn)定表達，已被證實可抑制相關(guān)炎癥介質(zhì)釋放，以減輕炎性反應(yīng)對機體造成的損傷[7,23-24]。本研究結(jié)果顯示，SIRT1在NEC新生大鼠體內(nèi)呈低表達狀態(tài)，而使SIRT1表達水平增高可以使促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)、促氧化因子(MDA、MCP-1、VCAM-1)的表達降低，而使抗炎因子(IL-10)、抗氧化因子(SOD)表達增加，從而使腸黏膜、肌層水腫減輕，腸黏膜絨毛脫落減少，病理評分降低。提示SIRT1的表達水平與NEC密切相關(guān)，SIRT1表達增加可能對減輕炎癥反應(yīng)及改善NEC腸組織損傷有一定作用，這與Bai等的研究結(jié)果一致[11]。

miRNA可影響細胞的增殖、分化和遷移，參與多種疾病的調(diào)控[25]。miR-34a作為目前國內(nèi)外的研究熱點，不僅被證實與腫瘤、骨關(guān)節(jié)疾病等關(guān)系密切[14-17]，還與先天性巨結(jié)腸等腸道疾病有關(guān)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在NEC新生大鼠體內(nèi)呈高表達狀態(tài)，降低miR-34a的表達水平，可使NEC大鼠體內(nèi)炎癥應(yīng)激反應(yīng)減輕，組織損傷減輕，可見miR-34a是導(dǎo)致NEC炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要因素。

本研究還發(fā)現(xiàn)，SIRT1激動劑不僅調(diào)控了下游的炎癥因子的表達水平，還影響了SIRT1及miR-34a的表達水平，原因可能是SIRT1激動劑調(diào)控了下游炎癥因子濃度，而下游炎癥因子濃度的改變間接影響了SIRT1和miR-34a的表達水平。Huang等[27]發(fā)現(xiàn)，低濃度TNF-α處理的成骨細胞中SIRT1的蛋白表達較高濃度組增加，證實了炎癥因子的濃度變化導(dǎo)致SIRT1表達變化的現(xiàn)象，但具體是通過何種機制進行調(diào)控，有待實驗進一步探究。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6水平發(fā)生變化會激發(fā)IL-6R/STAT3/miR-34a反饋環(huán)，從而導(dǎo)致miR-34a的表達變化[28]，還有一項關(guān)于炎癥反應(yīng)與miR關(guān)系的研究也證實了IL-6、IL-8及IL-10等炎癥因子可影響miR的表達[29]，故SIRT1激動劑對miR-34a表達的影響很可能是通過調(diào)控炎癥因子的濃度來實現(xiàn)的。

研究顯示，miR-34a可與SIRT1的3′端不翻譯區(qū)結(jié)合，抑制SIRT1的表達，從而影響腸上皮細胞氧化應(yīng)激與細胞凋亡的調(diào)控，參與小腸缺血再灌注損傷的病理過程[14-15,24]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a干擾片段可上調(diào)SIRT1的表達水平，改善NEC大鼠腸組織損傷，當(dāng)使用SIRT1抑制劑下調(diào)SIRT1的表達后，miR-34a干擾片段對NEC的修復(fù)作用也受抑制，證實miR-34a是通過調(diào)控SIRT1的表達參與NEC的發(fā)病。

本研究從炎癥反應(yīng)的角度出發(fā)，為NEC的發(fā)病機制提供了新的思路，但是上述結(jié)果系基于動物實驗得出，且實驗動物數(shù)量有限，其結(jié)論是否可用于臨床，仍需要多中心、大樣本量的人體臨床實驗進一步驗證。

綜上所述，miR-34a/SIRT1通路參與新生大鼠NEC的發(fā)生，機制可能是miR-34a下調(diào)SIRT1的表達，使促炎因子、促氧化因子釋放增加，抗炎、抗氧化水平降低，激發(fā)炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致NEC的發(fā)生發(fā)展。