人源性胃癌腫瘤組織移植免疫模型的建立與評價

陳 玲，劉 英，朱艷陽，胡 莉，張秋玉，2

胃癌是我國惡性腫瘤中危害最為嚴重的疾病之一。2020年，中國胃癌新發病例數48萬，死亡病例數37萬，發病人數和死亡人數分別占全球胃癌發病人數和死亡人數的44%和48%[1]。傳統的治療胃癌的方案包括放化療、手術及靶向治療等。目前，已有多項免疫治療研究在胃癌治療中開展[2-3]。2020年3月，程序性死亡受體(programed death-1, PD-1)阻斷劑納武利尤單抗在中國獲批用于治療晚期胃癌，標志著免疫治療在胃癌中取得重要進展。臨床Ⅲ期試驗顯示：PD-1抗體使得患者1 a生存率提高至27.3%，是對照組的2倍[4]。如何進一步提高PD-1抗體等免疫治療方案的受益患者比例是腫瘤免疫學研究領域的熱點問題。構建反映胃癌臨床特征的實驗動物模型，將有助于推進免疫治療方案在胃癌治療中的轉化應用，提高胃癌的免疫治療效果。

患者來源的腫瘤組織異種移植(patient derived xenograft, PDX)模型是通過將患者新鮮的腫瘤組織直接移植到免疫缺陷小鼠體內而建立的腫瘤模型[5-6]。該模型能更好地模擬人腫瘤組織的生長情況和微環境，并可在組織病理學、分子生物學和基因水平上保留原代腫瘤的大部分特點。因其具有較好的臨床療效預測性，被廣泛應用于腫瘤基礎研究及腫瘤藥物臨床前藥效評估[7-9]。然而，隨著免疫治療的迅速發展，如何在動物模型中重建人體免疫微環境成為亟待解決的問題。通常情況下，腫瘤組織中天然存在浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)，是免疫微環境的主要組成部分，并在清除腫瘤細胞中發揮重要作用[10]。在異種移植過程中，這些TIL能否隨腫瘤一起進入小鼠體內及在異體中的存活和狀態如何，相關研究仍較少。

本研究旨在建立胃癌免疫PDX模型，分析人源TIL在腫瘤組織及小鼠外周血的存活情況，為提高抗腫瘤免疫藥物治療胃癌的療效預測提供動物模型依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與臨床樣本 NCG(NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt)免疫缺陷小鼠，雌性，SPF級，6～8 周齡，體質量20～24 g[江蘇集萃藥康生物科技有限公司，許可證號：SCXK(蘇)2018-0008]，飼養于福建醫科大學實驗動物中心SPF屏障系統，并在實驗動物管理與使用指南下進行實驗(動物倫理審查號為2017-035)。選取2017年1—12月福建醫科大學附屬第一醫院胃腸外科手術切除并經病理證實的新鮮胃癌組織樣本3 例。術前均未接受任何治療。本研究經醫學倫理委員會批準，所有患者均自愿參加并簽署知情同意書{倫理審查號為[2017]福醫倫理審字第(27)號(2017vNO.27)}。

1.1.2 試劑 流式細胞術檢測抗體FITC標記的抗小鼠CD14、PE標記的抗人CD3及PerCPcy5.5標記的抗人CD8(美國Thermo Fisher Scientific公司)；免疫組織化學抗體羊抗人CD3(美國Abcam公司)；免疫組織化學染色試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 人胃癌腫瘤組織的移植與傳代 新鮮腫瘤組織在離體2 h內接種于NCG小鼠。初次移植的具體步驟如下：將腫瘤塊分成兩份，1份用于組織化學包埋和冰凍樣本保存；另1份平均切成多塊5 mm×5 mm×5 mm的正方小塊。NCG小鼠下背部中間縱向切口1 cm，用無菌棉球棒從切口伸入，由下而上推至上背部，為腫瘤塊的植入疏通皮下空間。將切好的腫瘤塊從切口移至小鼠上背部，兩側各移植1塊。縫合切口。待小鼠蘇醒后放入籠內并持續監測其腫瘤生長情況。再次移植傳代時，CO2窒息法處死荷瘤小鼠，無菌條件下取出皮下腫瘤，并切成3 mm×3 mm×3 mm的小塊。按上述方法接種至新的NCG小鼠皮下，此即第二代移植腫瘤(P1)，移植前保存部分第一代腫瘤組織(P0)。

1.2.2 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，H-E)及免疫組織化學染色 取移植前(primary)、移植后5周(P0)及二次傳代(P1)后2周的腫瘤組織浸泡于10%福爾馬林溶液中固定24 h；常規脫水制作石蠟切片。H-E染色觀察組織病理變化。羊抗人CD3抗體作為一抗，通過免疫組織化學染色觀察T細胞在組織中的浸潤情況。

1.2.3 流式細胞術分析 小鼠眼眶靜脈取血，裂解紅細胞后，制成單細胞懸液。加入抗小鼠CD16/CD32抗體封閉處理15 min，加入FITC標記的抗小鼠CD14、PE標記的抗人CD3和PerCPcy5.5標記的抗人CD8抗體，4 ℃避光染色30 min后上機進行流式細胞術分析。

1.3 統計學處理 腫瘤大小以長短徑的平均值表示，并用GraphPad Prism 8.0軟件進行作圖；采用FlowJo軟件分析流式細胞術檢測結果。

2 結 果

2.1 胃癌免疫PDX模型的建立 將胃癌腫瘤組織分為8 小塊，移植到4 只NCG小鼠(分別命名為P0-1、P0-2、P0-3和P0-4)背部兩側(L和R)。移植2 周后，4 只小鼠背部皮下均可見腫塊(圖1A)。隨著時間延長，接種的7 個腫塊直徑逐漸增大，且在移植8 周后生長更為迅速，生長特性符合腫瘤增殖的生物學特征;1 個腫塊未見明顯增長，且在移植8 周后開始減小(圖1B)。移植12周后，取生長迅速的腫瘤塊P0-2L傳代至2 只新的NCG小鼠皮下，即第二代(P1)，P1代腫瘤塊的生長速度較P0代更快(圖1C)。

PDX：患者來源的腫瘤組織異種移植。A：新鮮胃癌腫瘤組織及小鼠皮下移植5 周后腫瘤組織照片；B、C：原代移植(P0)及再次移植(P1)腫瘤組織的生長曲線。P0-1、2、3、4及P1-1、2代表不同NCG小鼠編碼，L和R代表左側和右側組織。

2.2 免疫PDX病理及組織化學分析 P0代腫瘤移植5周后，取出P0-3和P0-4荷瘤小鼠的腫瘤進行組織H-E及免疫組織化學染色分析。與Primary腫瘤組織比較，初次移植第5周(P0-3L)及再次移植第2周(P1-1L)的腫瘤組織仍保留胃癌細胞的形態特征，表現為細胞異形，核大小不一，核漿比例高。在移植與傳代過程中，亦可見腫瘤組織發生形態變化，包括：(1)腺管樣結構減少，移植前腫瘤組織中可見明顯的、較多的腺管樣結構散布其中，移植后腺管樣結構減少并且變小，再次移植腫瘤中無腺管樣結構；(2)人基質細胞減少，小鼠纖維細胞逐漸增多且侵入到腫瘤組織內部，逐漸取代人基質細胞。免疫組織化學染色顯示，Primary胃癌腫瘤組織中有較多的T淋巴細胞浸潤，P0代T細胞數量逐漸減少，P1代后腫瘤組織檢測不到T細胞(圖2)。

A：H-E染色結果；B：CD3免疫組織化學染色結果。Primary、P0和P1分別為新鮮、首次移植和再次移植后的腫瘤組織，3L及1L為移植小鼠的標號。

2.3 荷瘤小鼠外周血人源性T細胞分析 通過流式細胞術定期檢測荷瘤小鼠外周血人源性T細胞比例，可見移植2周后，小鼠外周血白細胞中人CD8+CD3+T細胞比例極低(<1%)，隨后開始上升；移植4～5周后，人CD8+CD3+T細胞比例達到峰值(P0-1小鼠為24.5%，P0-2小鼠為16%)，隨后開始下降；移植10周后，人CD8+CD3+T細胞比例仍為4%(圖3)。

PDX：患者來源的腫瘤組織異種移植。A：移植后不同時間點小鼠外周血CD3+CD8+T細胞比例的流式細胞術分析圖(設門在小鼠外周血活細胞中)；B：流式細胞術分析免疫結果的統計圖(P0-1及P0-2為初次移植的小鼠編號)。

3 討 論

隨著胃癌臨床免疫治療的推廣應用，相應的人源免疫系統PDX模型的構建逐漸成為研究熱點。利用PDX模型重建人源免疫系統，是研究腫瘤與免疫系統相互作用及評估預測免疫治療藥物抗腫瘤效果的關鍵。已有文獻報道，移植CD3陽性造血干細胞(hematopoietic stem cell, HSC)的免疫缺陷小鼠體內，可以產生包括人T、B細胞在內的多種免疫細胞[11-13]。但由于MHC的限制性，產生的人T細胞無法與小鼠抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)相互作用，導致腫瘤移植后不能產生有效的適應性免疫應答[14-15]。盡管自體同源的骨髓、胎肝和胸腺組織共移植到免疫缺陷小鼠體內，可以克服上述問題，但這些組織較難獲得，模型建立過程復雜且耗時較長，其廣泛應用具有一定的局限性[16-17]。相較于人造免疫系統，隨腫瘤組織一起移植的TIL更能充分反映原代腫瘤的免疫微環境。本研究從胃癌手術中獲取新鮮腫瘤組織構建PDX模型。鑒于已有的研究報道TIL主要集中于腫瘤周邊組織[7]，本研究取材時選擇靠近正常組織邊緣的腫瘤組織。免疫組織化學結果顯示，移植5周后仍能在腫瘤組織中檢測CD8 T細胞的浸潤，但再次移植2周后腫瘤組織無法檢測到CD8 T細胞。這些結果為探索潛在的腫瘤免疫藥物提供了實驗模型。本研究結果提示，移植后5周的人胃癌免疫模型仍可用于研究腫瘤與免疫系統相互作用，不建議使用多次傳代的移植模型。

本研究分析了胃癌PDX模型小鼠外周血的人源T細胞比例變化，結果發現：在移植后2周即可在小鼠外周血測到腫瘤組織來源的CD3+CD8+T細胞，隨后比例逐漸上升，提示PDX模型小鼠體內存在人源T細胞擴增現象。Simpson-Abelson等[18]報道，人源CD8T細胞在人肺癌PDX模型小鼠體內有擴增現象。根據已有的文獻報道，人源CD8T細胞擴增的可能原因：(1)移植受體為免疫缺陷小鼠，其獲得性免疫功能完全消失，天然免疫功能也大部分受損，無法清除或抑制外源T細胞；(2)腫瘤組織中存活的人CD8 T表型多為記憶細胞，可通過識別腫瘤細胞表面抗原而活化增殖[19]。本研究發現，移植后4～5周，外周血中人源T細胞比例達到峰值，隨后開始下降，移植后10周仍可檢測到人CD8 T細胞。由于移植物來源的TIL大多是經歷腫瘤抗原的特異性活化的寡克隆，其識別小鼠組織而引發移植物抗宿主(graft versus host disease, GVDH)的能力有限[20]。一旦小鼠發生GVDH效應后，可導致小鼠外周血中人源T細胞持續增加，直至小鼠發生死亡。本研究通過動態監測移植瘤小鼠外周血T細胞比例的變化規律后，基本可以排除GVHD的作用。因此，筆者推測，擴增的T細胞可能是記憶T細胞識別腫瘤抗原后發生活化增殖所致。類似研究也報道，PDX模型中CD8 T細胞隨腫瘤進入小鼠后可在體內存活63～290 d[21-22]，人CD8 T細胞存活的時間受腫瘤類型、腫瘤組織大小、取材部位及受體小鼠的狀態等多種因素影響。

綜上所述，本研究探索了人胃癌腫瘤組織來源的免疫PDX模型的構建方案，提示該模型進行腫瘤免疫研究的最佳時間段，即移植后3～8周人源T細胞存活較多的階段。盡管免疫PDX模型仍存在諸多問題，但其仍是較為客觀地反映腫瘤患者體內免疫微環境的實驗模型，可推廣應用于免疫治療藥物的機制研究與臨床前試驗。后續將進一步探索如何在免疫PDX模型腫瘤組織中更有效保留人源T細胞，避免T細胞外滲至外周血及其他免疫器官。