孕期鎘暴露后子代成年卵巢顆粒細胞激素合成基因相關microRNA表達譜改變

劉張嬪，李慶宇，呂亞可，李靜雯，張文昌

鎘對雌性性腺的毒性是目前研究的熱點之一，子宮和卵巢是其靶器官，且鎘能通過胎盤，影響子代雌孕激素的合成與分泌[1]。課題組先前的研究發現，孕期鎘暴露致子代成年雌性大鼠孕酮含量下降[2]。而microRNA(miRNA)可參與調控卵巢顆粒細胞雌孕激素的合成與分泌[3]。本課題擬建立孕期鎘暴露動物模型，篩選子代中可能參與調控卵巢顆粒細胞雌孕激素合成與分泌相關miRNAs，并進行生物信息學分析，探討鎘致子代雌孕激素合成障礙的可能機制，為進一步研究子代卵巢損害的表觀遺傳機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 氯化鎘(純度：99%，美國Sigma公司)；SPF級SD大鼠[上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0002]。

1.2 卵巢顆粒細胞提取 無菌條件下，迅速從大鼠背部取出雙側卵巢，置于經37 ℃孵育、含雙抗(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L)的DMEM-F12培養液中清洗，洗凈后換置新的預熱DMEM-F12培養液。體式顯微鏡下用25號針頭刺破卵泡，引導顆粒細胞流出。收集所有細胞液，用0.075 mm(200目)不銹鋼過濾網過濾，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS重懸細胞，按1∶1的比例將懸液加入已配好的50% Percoll分離液上，400×g離心20 min，吸取中間白色顆粒細胞層，加入PBS，1 000 r/min條件下離心5 min，洗滌2次，加入適量含雙抗的DMEM-F12+10%FBS培養基制成單細胞懸液，血球計數板計數，調整細胞濃度為1×106個/mL，移至培養皿中，置于37 ℃培養箱中培養24 h，提取顆粒細胞總RNA。

1.3 獲取卵巢顆粒細胞miRNA芯片數據 大鼠孕期分別予生理鹽水、8 mg/kg氯化鎘灌胃染毒，自然分娩獲F1代；常規飼養至成年，與新購健康雄性大鼠交配產F2代。提取F1、F2代成年雌性大鼠卵巢顆粒細胞總RNA。RNA標記及芯片雜交等具體操作由上海康成生物公司完成。從以下3個來源探索性地篩選出可能調控子代雌孕激素合成的miRNAs。

1.3.1 miRNA芯片表達譜 以差異表達倍數(fold change, FC)>2.0且P<0.05為判斷標準，挑選出差異表達的miRNAs納入備選。以FC>2.0為判斷標準，挑選出差異表達的miRNAs納入備選。

1.3.2 數據庫預測的靶miRNA 使用TargetScan、miRWalk和miRDB在線預測軟件對甾體合成急性調節蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)及類固醇生成因子1(steroidogenic factor-1,Sf-1)、細胞色素P450側鏈裂解酶(Cyp11a1)、細胞色素P450羥化酶(Cyp17a1)和細胞色素P450芳香化酶(Cyp19a1)等雌孕激素合成過程中的關鍵基因進行靶miRNA預測，將SUM≥2的靶miRNAs納入備選。

1.3.3 文獻檢索 利用Pubmed、中國知網、萬方數據庫檢索國內外文獻，將與卵巢顆粒細胞合成雌孕激素相關的miRNAs納入備選。

1.4 生物信息學分析 應用TargetScan、miRWalk和miRDB在線預測軟件預測篩選的miRNAs的可能靶基因，取三者交集，應用在線數據庫DAVID系統(http://david.ncifcrf.gov/)將獲得的靶向基因進行GO(Gene ontology)及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)pathways富集分析。

2 結 果

2.1 卵巢顆粒細胞miRNA芯片分析

2.1.1 以FC>2.0作為判斷標準 使用FC>2.0作為篩選條件，篩選差異表達的miRNAs，F1代篩選出76個miRNAs，其中31個上調，45個下調；F2代篩選出63個miRNAs，其中22個上調，41個下調。

2.1.2 以FC>2.0且P<0.05作為判斷標準 使用FC>2.0且P<0.05作為篩選條件篩選差異表達的miRNAs，F1代篩選出3個miRNAs，其中 2個上調，1個下調；F2代篩選出7個miRNAs，其中6個上調，1個下調(表1、2)。

表1 F1代差異表達的microRNAs

表2 F2代差異表達的microRNAs

2.2 miRNAs篩選

2.2.1 以FC>2.0且P<0.05作為判斷標準 通過miRNA芯片差異表達分析、數據庫預測和文獻檢索篩選出可能調控子代雌孕激素合成的miRNAs，F1代挑選出2個miRNAs：rno-miR-532-3p、rno-miR-92a-2-5p；F2代挑選出4個miRNAs：rno-miR-125a-3p、rno-miR-132-3p、rno-miR-28-3p、rno-miR-125b-1-3p。

2.2.2 以FC>2.0作為判斷標準 同上，F1代挑選出25個可能的miRNAs：rno-miR-132-5p、rno-miR-184、rno-miR-708-5p、rno-miR-628、rno-miR-3577、rno-miR-18a-5p、rno-miR-27a-3p、rno-miR-532-5p、rno-miR-182、rno-miR-122-5p、rno-miR-532-3p、rno-miR-431、rno-miR-326-3p、rno-miR-758-5p、rno-miR-92a-2-5p、rno-miR-151-3p、rno-miR-128-3p、rno-miR-126a-5p、rno-miR-148a-3p、rno-miR-1-3p、rno-miR-187-5p、rno-miR-103-1-5p、rno-miR-27a-5p、rno-miR-96-5p、rno-miR-29b-5p；F2代挑選出20個可能的miRNAs：rno-miR-146a-5p、rno-miR-222-3p、rno-miR-883-5p、rno-miR-874-5p、rno-miR-193a-3p、rno-miR-125a-3p、rno-miR-132-3p、rno-miR-138-5p、rno-miR-143-3p、rno-miR-24-2-5p、rno-miR-28-3p、rno-miR-30d-3p、rno-miR-145-5p、rno-miR-532-3p、rno-miR-125b-1-3p、rno-miR-135b-5p、rno-miR-29a-5p、rno-miR-96-5p、rno-miR-126a-5p、rno-miR-181d-3p。

2.3 生物信息學分析

2.3.1 靶基因GO富集分析

2.3.1.1 以FC>2.0且P<0.05作為判斷標準 對F1代篩選的rno-miR-532-3p、rno-miR-92a-2-5p的靶基因進行GO富集分析，富集到與雌孕激素相關的生物學功能為卵巢卵泡發育。對F2代篩選出的4個miRNAs進行GO富集分析，富集到兩個相關的生物學功能：MAPK級聯和胚胎發育。

2.3.1.2 以FC>2.0作為判斷標準 分別對F1、F2代篩選出來的25、20個miRNAs的靶基因進行GO富集分析，取排名前10的結果(圖1、2)。挑出與雌孕激素相關的富集結果，F1代25個miRNAs主要位于膜區域，具有類固醇激素受體活性，參與女性性腺發育、類固醇激素介導的信號通路等生物過程。F2代20個miRNAs主要位于細胞質區域，具有mRNA 3′-UTR結合活性，參與膽固醇生物合成過程的負調控、生殖發育過程、對雌二醇的反應等生物學過程。

圖1 F1代microRNAs靶基因GO富集分析

2.3.2 靶基因KEGG富集分析

2.3.2.1 以FC>2.0且P<0.05作為判斷標準 對F1代篩選的2個rno-miR-532-3p和rno-miR-92a-2-5p的靶基因進行KEGG分析，未富集到相關通路。對F2代篩選的4個miRNAs的靶基因進行KEGG分析，富集到FOXO信號通路與雌孕激素相關。

2.3.2.2 以FC>2.0作為判斷標準 分別對F1、F2代篩選出的25、20個miRNAs的靶基因進行KEGG分析，富集得分排名前10位如圖3、4所示。F1代富集到雌激素信號通路、Wnt 信號通路[4]、cAMP信號通路[5]、孕激素介導的卵母細胞成熟、FOXO信號通路[6]、MAPK信號通路[7]、PI3K-Akt信號傳導途徑[8]等7條與雌孕激素作用相關的通路。F2代富集到與雌孕激素相關的通路有孕激素介導的卵母細胞成熟、MAPK信號通路和cAMP信號通路。

圖2 F2代microRNAs靶基因GO富集分析

圖3 F1代microRNAs靶基因KEGG富集分析

圖4 F2代microRNAs靶基因KEGG富集分析

3 討 論

孕期鎘暴露會影響子代卵巢顆粒細胞雌孕激素合成與分泌。課題組前期研究表明，孕期鎘暴露后F1代和F2代雌性子代卵巢顆粒細胞上清液孕酮水平降低，合成雌孕激素的關鍵基因StAR和Cyp11a1的蛋白表達水平均顯著下降[2]。但鎘引起子代雌孕激素合成與分泌障礙機制尚未清楚，而表觀遺傳學修飾被認為起重要作用。

miRNAs是一類20～24個核苷酸單鏈非編碼RNA分子，在轉錄后水平對基因表達起著關鍵的調控作用[9]。眾多研究表明，許多miRNAs在雌孕激素合成與分泌過程中有著重要的調控作用[3,9]。但較少研究關注鎘暴露引起的多代類固醇激素合成障礙中miRNAs是否發揮重要作用。本研究采用孕期鎘暴露后子代卵巢顆粒細胞的miRNA芯片表達譜，以FC>2.0、P<0.05為判斷標準，在F1和F2代分別獲取有3、7個顯著差異表達的miRNAs；以FC>2.0為標準篩選芯片差異表達的miRNAs，再綜合數據庫預測和文獻檢索進行分析，F1和F2代分別篩選出25、20個可能調控子代雌孕激素合成與分泌的miRNAs，該部分結果表明與雌孕激素合成基因相關的miRNA表達譜在孕期鎘暴露的兩代子代中均發生變化。而課題組先前研究已證實，孕期鎘暴露后兩代子代合成孕酮能力顯著下降，并且發現在F1代和F2代中均表達上調的miR-10b-5p和miR-27a-3p，可通過靶向StAR介導子代卵巢顆粒細胞功能損傷[2]，說明miRNAs確實參與了子代激素合成障礙的調控。結合本研究兩代子代的GO分析均富集到與雌孕激素相關的生物學過程，其中女性性腺發育與雌孕激素密不可分[10]；類固醇激素介導的信號通路可能和雌孕激素的作用途徑相關；膽固醇是合成雌孕激素的原料[11]，對其生物合成過程的調控會直接影響激素的合成。KEGG分析均富集到與雌孕激素作用的相關通路。已有研究表明，重金屬鎘可通過抑制 cAMP信號通路和類固醇生成酶StAR、Cyp11a1和3βHSD的活化，顯著降低類固醇激素水平[5]，提示孕期鎘暴露后子代成年卵巢顆粒細胞中與雌孕激素相關的miRNAs會發生改變，并且可能在鎘致子代孕酮合成障礙中發揮一定作用，需引起重點關注。

孕期鎘暴露，F1代為胚胎，屬于直接暴露；F2代為F1代胚胎中原始生殖細胞，屬于間接暴露。課題組既往研究發現[2]，孕期鎘暴露后的F1代和F2代成年卵巢顆粒細胞激素表型變化一致，提示本模型中激素表型存在代際效應，故以miRNAs改變為代表的表觀遺傳學修飾表型是否也存在代際效應是本次研究的關注重點之一。miRNAs在卵母細胞中存在為其代際效應提供了理論基礎。Nilsson等[12]的研究發現，在F0代孕期暴露于vinclozolin或DDT的F3代卵巢顆粒細胞中長鏈非編碼RNA和非編碼小RNA均存在差異表達，因其未做F1～F3代非編碼RNA的比較，故僅能提示表觀遺傳學修飾表型可能存在代際或跨代效應。本研究以FC>2.0作為判斷標準，F1代和F2代分別篩選出的25、20個目標miRNAs中存在3個共同的miRNAs，包括rno-miR-532-3p、rno-miR-126a-5p和rno-miR-96-5p，表明孕期鎘暴露后，與雌孕激素合成相關的miRNAs可能出現傳代效應，可進一步確認其是否在F2代中差異表達。

F1和F2代的KEGG分析結果均涉及cAMP信號通路、MAPK信號通路和孕激素介導的卵母細胞成熟。研究表明，在人乳腺癌細胞、人支氣管上皮細胞、腎系膜細胞等細胞系中，鎘暴露可激活MAPK信號通路[13-14]，MAPK信號通路與雌孕激素相關[7]，但鎘是否會通過MAPK信號通路對卵巢顆粒細胞合成與分泌雌孕激素造成影響未知。陽良生等[15]的研究表明，孕酮誘發兩棲類卵母細胞成熟。基于以上結果，前兩條通路可能是孕期鎘暴露后兩代子代孕酮合成障礙的共同機制，需在今后進一步驗證。

本研究僅在F1代富集到雌激素信號通路、Wnt 信號通路、PI3K-Akt信號傳導途徑、FOXO信號通路。人腎近曲小管細胞系氯化鎘暴露可激活PI3K-Akt信號傳導途徑[16]。Hu等[8]的研究表明，PI3K-Akt信號傳導途徑參與顆粒細胞類固醇激素合成。鎘暴露誘導的氧化應激與FOXO相關，且FOXO作為一種轉錄因子參與調控雌孕激素合成[17]。本研究僅在F1代富集到的PI3K-Akt信號傳導途徑和FOXO信號通路，可能僅在F1代影響孕酮合成，并且可能是F1與F2代導致孕酮合成障礙的不同機制，但仍有待進一步驗證。

綜上所述，孕期鎘暴露致子代卵巢顆粒細胞雌孕激素合成分泌障礙的機制中，相關的miRNA表達譜有發生變化，部分miRNAs出現代際效應。結合課題組以往的研究結果及本研究的生信分析，提示miRNAs可能在兩代子代孕酮合成障礙中起重要的調控作用；cAMP信號通路和MAPK信號通路可能是兩代孕酮合成受損的共同機制，而PI3K-Akt信號傳導途徑和FOXO信號通路可能是F1代孕酮水平下降比F2代更為顯著的原因。