RAD51表達與肝細胞癌增殖侵襲能力及預后的關系

帕成周 張貫啟 鄔善敏

原發性肝癌是我國第4位常見的惡性腫瘤，在腫瘤致死病因中位居第2位[1]。近年來肝癌在男性和女性中的發生率均有不同程度的增加，其5年生存率為18%[2]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的原發性肝癌類型，進展至晚期時預后極差，僅有5%～10%的早期患者具備手術切除的條件[3]。

DNA損傷通常是由多種內源性和外源性因素引起的，如紫外線、輻射、化學因素、活性氧、DNA復制錯誤等。當發生DNA單鏈或雙鏈斷裂時會引起基因組不穩定，基因組不穩定性被廣泛認為是腫瘤的標志性特征之一，在腫瘤的發生、發展中起著重要作用[4]。為了對抗DNA損傷，機體啟動損傷修復機制來修復和維持基因組的穩定性，DNA單鏈斷裂時進行堿基異常修復(base-excision repair, BER)，DNA雙鏈斷裂則可通過非同源末端鏈接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重組(homologous recombination, HR)方式進行修復[5, 6]。RAD51是HR修復DNA雙鏈斷裂的關鍵蛋白之一，在前列腺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、結腸癌中發揮致癌基因的作用[7～13]。然而，RAD51表達在肝細胞癌中的臨床價值和生物學功能尚未完全闡明。本研究旨在探討RAD51表達與HCC患者臨床病理特征及預后的關系，探究其表達與肝癌SMMC-7721細胞增殖、遷移侵襲能力的關系。

材料與方法

1.數據獲取及生存分析：2020年6月使用癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫(https:∥portal.gdc.cancer.gov/)下載HCC患者臨床資料和RNA-seq表達數據。該數據集包括374例HCC組織和50例癌旁組織。根據RAD51的中位表達將HCC患者分為高低表達兩組，使用Kaplan-Meier Plotter網站(https:∥kmplot.com/analysis/)進行生存分析。

2.細胞系及主要實驗材料：人正常肝細胞系L02和人肝癌細胞系SMMC-7721(中國科學院細胞庫)、RPMI 1640培養基(美國HyClone公司)、10%胎牛血清(美國HyClone公司)、RAD51 siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)、RAD51抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)、CCK-8檢測試劑盒(大連美侖生物技術有限公司)。細胞放置于37℃ 5%CO2的培養箱，待細胞貼壁繁殖達培養瓶底部面積80%左右用胰酶細胞消化液進行消化傳代。

3.實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)：將細胞硏磨裂解后加入1ml Trizol Reagent抽提總RNA，使用反轉錄試劑盒合成cDNA，按FastStart Universal SYBR Green Master(Rox) 試劑盒說明書配制反應體系并進行定量PCR反應，采用2-ΔΔCT法計算RAD51 mRNA相對表達量。內參基因 GAPDH及RAD51引物序列詳見表1。

表1 引物序列

4.細胞轉染及篩選：細胞轉染采用小干擾RNA技術構建RAD51敲低質粒，設計3條si-RAD51干擾序列，設置SMMC-7721正常對照組(Control組)、空載組(si-NC組)、轉染組(si-RAD51-1、si-RAD51-2、si-RAD51-3組)共5組。將SMMC-7721細胞接種在6孔板上，采用lipofectamin 2000方法在無血清培養基中進行細胞轉染，溫育6h后更換新鮮含血清培養基，溫育48h后收集細胞用于qPCR和 Western blot法篩選出干擾效果最佳的轉染組細胞系。以Control組、si-NC組、干擾最佳si-RAD51組進行生物學功能實驗。

5.CCK-8增殖實驗：根據CCK-8檢測試劑盒說明書進行實驗，測定48h各組SMMC-7721細胞存活率。

6.Transwell遷移及侵襲實驗：遷移實驗將處理后的各組細胞加入200μl的無血清培養基分別配制成含有2×104個的細胞懸液, 接種于Transwell小室上室；侵襲實驗將各組細胞配制成含有2.5×104個的細胞懸液，接種于BD matrigel和RPMI-1640以1∶3的比例制備而成的侵襲小室上室。下室加入500μl 含10% FBS的完全培養基，在37℃ 5%CO2的培養箱中培養24h后取出，PBS洗去培養基，結晶紫染色10min，擦除干凈，顯微鏡下隨機選取3個視野拍照。

7.基因集富集分析：基因集富集分析使用GSEA軟件(v.4.0.3，https:∥www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)進行，以“c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt”, “c5.all.v7.1.symbols.gmt” 作為參考數據集，隨機運行次數設置為1000，以P<0.01、FDR<0.05作為過濾條件，進行GO功能注釋和KEGG通路分析。

8.統計學方法：采用GraphPad Prism 8統計學軟件對數據進行統計分析，兩獨立樣本的差異采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.RAD51 mRNA表達結果：利用TCGA分析發現，RAD51 mRNA在HCC組織中的表達水平明顯高于鄰近正常肝組織(t=6.35,P<0.01, 圖1A)。通過qPCR分析RAD51 mRNA在L02和SMMC-7721中的表達情況，結果顯示RAD51 mRNA在肝癌細胞系中表達顯著高于正常肝細胞系(t=6.96,P<0.01, 圖1B)。

圖1 RAD51 mRNA在肝細胞癌組織和細胞中的表達情況A.TCGA數據庫中組織水平表達情況；B.細胞系水平表達情況

2.RAD51 mRNA表達與HCC患者臨床特征：RAD51 mRNA表達水平在年齡(<60歲 vs ≥60歲，P<0.01，圖2A)、病理分級(G1和2 vs G3和4，P<0.01，圖2C)、臨床分期(stageⅠ vs stage Ⅱ和stageⅠ vs stage Ⅲ和Ⅳ，P<0.01，圖2D)、T分期(T1vs T2、T1vs T3、T1vs T4，P<0.05，圖2E)差異有統計學意義。

圖2 RAD51 mRNA表達與HCC患者臨床特征的關系A.年齡；B.性別；C.病理分級；D.臨床分期；E.T分期；F.N分期

3.RAD51 mRNA表達與預后：利用Kaplan-Meier Plotter網站根據RAD51表達中位值將HCC患者分為高低表達兩組進行生存分析，RAD51低表達的HCC患者總生存期(overall survival, OS)優于高表達的HCC患者(HR=1.62, 95% CI:1.14～2.30,P<0.01，圖3)。其中，RAD51低表達組患者的中位生存時間為70.5個月；高表達組的中位生存時間為45.7個月。此外，通過單因素和多因素COX分析驗證了RAD51表達是否為HCC患者OS的獨立預后因素。單因素COX分析顯示，RAD51表達、臨床分期、腫瘤直徑、遠處轉移與HCC患者的OS密切相關(表2)；在多因素COX分析中進一步提示RAD51表達是OS的獨立預后指標(HR=1.31, 95% CI:1.10～1.55,P<0.01)。

圖3 RAD51 mRNA表達與HCC患者預后的生存曲線

表2 單因素COX分析HCC患者臨床特征和總體生存率的相關性

4.干擾效率的驗證結果：將3條RAD51干擾序列轉染至SMMC-7721細胞，通過qPCR和 Western blot法檢測其mRNA表達改變。結果發現在SMMC-7721細胞中，si-RAD51-1組、si-RAD51-3組與Contorl組比較RAD51 mRNA表達水平明顯降低(F=40.6,P<0.01，圖4)。其中si-RAD51-3干擾效果最佳，選擇此干擾作為后期實驗組研究對象。

圖4 干擾載體在SMMC-7721細胞干擾效率的驗證A.qPCR；B.Western blot法檢測;與Control組比較, *P<0.05, **P<0.01，#P>0.05

5.增殖實驗結果：48h CCK-8實驗結果表明， si-RAD51組細胞存活率顯著低于Control組、si-NC組細胞存活率(F=27.9，P<0.01，圖5)。

圖5 沉默RAD51后SMMC-7721細胞的存活率與Control組比較,*P<0.01，#P>0.05

6.Transwell小室實驗結果：si-RAD51組與Control組、si-NC組比較，SMMC-7721細胞的遷移能力受到抑制(F=39.8，P<0.01)，侵襲能力也受到抑制(F=11.1，P<0.01，圖6)。

圖6 沉默RAD51后SMMC-7721細胞Transwell小室實驗(×200)A.Transwell遷移實驗；B.Transwell侵襲實驗；與Control組比較, * P<0.01，#P>0.05

7.GSEA基因集富集分析結果：通過GSEA進行RAD51基因GO功能注釋和KEGG通路分析，結果顯示HCC中與RAD51高表達相關的15個顯著富集的GO功能注釋和KEGG通路。RAD51主要位于染色體著絲粒區域，具有基因沉默、DNA包裝、DNA復制、mRNA結合、細胞周期調控等分子功能，參與細胞周期的負調控、p53介導的細胞信號轉導途徑調控基因表達等生物學過程。RAD51基因可能在細胞周期、核苷酸切除修復、剪接體、錯配修復、堿基切除修復、同源重組、N-聚糖生物合成、泛素介導的蛋白水解、p53信號通路等通路中發揮作用。

討 論

RAD51基因位于染色體15q15.1上，由13個外顯子組成，編碼RAD51蛋白家族成員，參與HR和DNA修復[14]。它與5個RAD51樣基因XRCC2、XRCC3、RAD51B(RAD51L1)、RAD51C(RAD51L2)和RAD51D(RAD51L3)在基因修復中起著至關重要的作用[15]。然而，RAD51在HCC中的臨床意義和生物學功能仍有待研究。

本研究發現RAD51 mRNA在HCC組織中表達上調，同時，RAD51在肝癌SMMC-7721細胞中的表達顯著高于正常肝L02細胞。生存分析數據顯示，RAD51高表達組與低表達比較，其總體生存期更差。多因素COX分析中進一步提示RAD51表達水平可以作為HCC患者的獨立預后指標。人類癌癥的病程是由解剖學上的疾病階段和腫瘤生長速度決定的。TNM分期通過腫瘤直徑(T分期)、有無局部淋巴結轉移(N分期)及有無遠處轉移(M分期)來確定腫瘤的進展程度。探索RAD51 mRNA表達水平與HCC患者臨床特征關系時，發現RAD51表達增加與更高的病理分級、臨床分期和腫瘤直徑相關，提示RAD51高表達可能促進腫瘤進展。本研究結果顯示RAD51 mRNA表達水平與HCC患者有無局部淋巴結轉移不相關，但相關研究表明高表達的RAD51在乳腺癌中可以促進局部淋巴結轉移的發生[16, 17]。出現這一現象的原因可能是由于在HCC患者臨床特征數據中N分期的病例數缺失較多(占比30.8%)所致，需在實驗研究和實際工作中進一步驗證。

此外，筆者還進行了體外細胞學實驗來研究RAD51的表達對肝癌細胞生物學功能的影響。本研究利用siRNA沉默肝癌SMMC-7721細胞中RAD51的表達，探討RAD51與肝癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的關系。48h CCK-8實驗結果顯示抑制RAD51后SMMC-7721細胞的增殖能力下降，Transwell細胞實驗結果顯示沉默RAD51后，無論是遷移細胞數還是侵襲細胞數均明顯減少，提示沉默RAD51可以抑制SMMC-7721細胞的遷移侵襲能力。本研究通過基因集富集分析明確了RAD51基因的功能及其發揮生物學作用的可能通路。RAD51主要位于染色體著絲粒區域，具有基因沉默、DNA包裝、DNA復制、mRNA結合等功能，參與p53介導的細胞信號轉導途徑以及周期負調控，與現有關于RAD51結構和分子功能的研究結果基本一致。RAD51的高表達在HCC中富集于p53、N-聚糖生物合成、泛素介導的蛋白水解等通路，這些生物學過程的異常已被證實與癌癥進展有關。細胞蛋白的降解是一個復雜且精細的過程，絕大多數依賴泛素-蛋白酶體系統進行，細胞周期調節蛋白的水解異常致使細胞周期次序及細胞內環境紊亂，與細胞轉化和惡性腫瘤的發生密切相關[18]。近年來有研究表明RAD51可以指導癌癥患者的臨床治療及評估療效[19～21]。隨著我國人口老齡化趨勢愈加明顯，部分難以耐受手術者或腫瘤復發難以切除者需進行手術以外的其他手段治療。抑制RAD51的表達可以改善腫瘤患者化療、放療耐受的情況，這一現象發生在乳腺癌、鼻咽癌、食管癌等多種惡性腫瘤疾病中[22～26]。RAD51的表達還與內分泌治療、免疫治療相關，抑制RAD51的表達可能對腫瘤治療的方式及手段產生影響，具有重要的臨床應用前景。

綜上所述，本研究結果提示RAD51高表達與HCC患者更高的病理分級、臨床分期密切相關，是影響總體生存預后的獨立危險因素，沉默其表達可顯著抑制肝癌SMMC-7721細胞的增殖、遷移及侵襲能力。在未來，關于RAD51的臨床應用和轉化研究將有助于更好地了解同源重組在惡性腫瘤中的作用。