LncRNA-SNHG3通過Hedgehog通路對乳腺癌細胞增殖的作用

李 妍 馬小平 劉 丹 趙 兵

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是全球女性癌癥相關死亡的第二大原因[1]。據統計，2018年中國乳腺癌發生率為36.1%，病死率為8.8%[2]。盡管近年來，診斷方法和治療措施在不斷優化，但乳腺癌患者的5年總生存率仍然很低[3]。因此，迫切需要進一步探究乳腺癌的發病機制。長非編碼RNA(long non-coding RNAs，LncRNAs)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，在不同的病理生理過程中發揮著一系列特定的功能[4]。LncRNA小核仁RNA宿主基因3(small nucleolar RNA host gene 3，SNHG3)與腫瘤進展和不良預后有關[5]。已有相關文獻證明，敲低SNHG3可抑制體外乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，抑制體內腫瘤生長[6]。然而SNHG3在乳腺癌中的作用機制尚不明確，還需要進一步探索。Hedgehog信號通路是一條從細胞膜到細胞核的高度保守的信號傳遞進化途徑，在胚胎發育過程中起著重要作用[7]。有研究發現， LncRNA EGOT通過激活Hedgehog途徑促進胃癌細胞增殖，使細胞周期阻滯于G1期，從而促進胃癌的進展[8]。目前，還未有關于SNHG3調控Hedgehog信號通路的相關報道。本研究旨在探究SNHG3是否通過調控Hedgehog通路影響乳腺癌細胞增殖，以期為明確乳腺癌的發病機制及開發新的癌癥治療靶點提供新的科學資料。

材料與方法

1.材料：乳腺癌細胞MDA-MB-453和HEK-293T細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；sh-NC、sh- SNHG3、oe-NC、oe- SNHG3和病毒包裝質粒購自上海吉滿生物科技有限公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；cyclopamine購自美國MedChemExpress公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；2×SYBR Green qPCR Mix購自美國Bimake公司；GLI1抗體購自英國Abcam公司。

2.細胞培養：MDA-MB-453用含10%胎牛血清的PRMI1640培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。HEK-293T細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，細胞置于37℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞融合度達到90%左右時，胰酶液消化細胞，按照1∶3比例進行傳代培養。

3.慢病毒包裝：取對數期生長的HEK-293T細胞，將其接種于6孔板，每孔1×106個細胞，細胞繼續培養24h后，棄去細胞舊培養基，更換為新鮮培養基。將1.5μg sh-NC、sh- SNHG3、oe-NC和oe- SNHG3質粒分別加入到含1.5μg 病毒包裝質粒的250μl的無血清DMEM中，另外將6μl LipofectamineTM2000加到250μl的無血清DMEM中，將兩管溶液室溫孵育5min，隨后將兩管溶液充分混勻，繼續孵育20min，加入到細胞中。細胞置于37℃、5% CO2培養箱中培養72h。收集細胞上清液，3000r/min離心20min，棄去細胞碎片。慢病毒液置于-80℃條件下保存。

4.慢病毒感染：將對數期生長的MDA-MB-453細胞接種于6孔板，每孔1×105個細胞，細胞繼續培養24h后，添加含有6μg/ml polybrene的新鮮培養基。將細胞隨機分為對照組、sh-NC組、sh-SNHG3組、oe-NC組、oe-SNHG3組和oe- SNHG3+cyclopamine組，按照分組，各添加 30 MOI相應慢病毒液，對照組細胞正常培養。細胞繼續培養72h后，向oe- SNHG3+cyclopamine組細胞中加入10μmol/L的cyclopamine，其余組細胞加入等量PBS。細胞繼續培養24h后，進行后續實驗操作。

5.RT-qPCR檢測SNHG3 mRNA表達：收集慢病毒感染后的MDA-MB-453細胞，加入Trizol試劑裂解細胞，提取RNA并立即反轉錄合成cDNA。按照2×SYBR Green qPCR Mix使用說明書所示，配制RT-PCR反應體系，反應程序為：95℃、2min；95℃、15s，58℃、15s，72℃、40s，40個循環；72℃ 5min延伸。以U6 mRNA表達量為內參，采用2-ΔΔCt法計算SNHG3 mRNA表達。實驗中所需引物序列為SNHG3(上游引物：5′- TTCAAGCGATTCTCGTGCC-3′； 下游引物：5′-AAGATTGTCAAACCCTCCCTGT-3′)，U6(上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′； 下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′)。

6.CCK-8檢測細胞活力： 將MDA-MB-453細胞接種于96孔板中，每孔細胞數量為5×103個。細胞繼續培養12、24、48和72h后，向每孔細胞中加入10μl CCK-8溶液，將培養板置于37℃培養箱中孵育4h，用酶標儀測定各孔在450nm處的吸光度(A)值。

7.克隆形成實驗檢測細胞增殖：將慢病毒感染后的MDA-MB-453細胞接種于培養皿中，每皿接種300個細胞。細胞置于37℃、5% CO2培養箱中連續培養2周。棄去培養液，4%多聚甲醛室溫固定細胞15min。吉姆薩染色液染色10min后，流水沖洗，空氣干燥。肉眼直接計數克隆數。

8.Western blot法檢測Gli1蛋白表達：收集慢病毒感染后的MDA-MB-453細胞，蛋白裂解液裂解細胞后，收集細胞上清液。取20μg蛋白加入到凝膠中，進行電泳操作。電泳結束后，將蛋白質轉印至PVDF膜上。加入5%脫脂奶粉室溫下封閉PVDF膜3h。隨后加入GLI1抗體(1∶2000)，4℃條件下孵育過夜。加入特異性二抗(1∶5000)，室溫孵育1h。向PVDF膜均勻滴加ECL化學發光試劑，暗室曝光。Image J軟件進行蛋白條帶的灰度分析。

結 果

1.慢病毒感染效率檢測：熒光顯微鏡觀察各組細胞發光情況，結果顯示，除對照組細胞外，其余組細胞均高表達綠色熒光。與對照組比較，sh-NC組和oe-NC組細胞中SNHG3 mRNA的表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與sh-NC組比較，sh- SNHG3組細胞中SNHG3 mRNA的表達明顯降低(P<0.05)；與oe-NC組比較，oe- SNHG3組細胞中SNHG3 mRNA的表達明顯升高(P<0.05，圖1、圖2)。

圖1 熒光顯微鏡觀察慢病毒感染后MDA-MB-453細胞發光情況(×200)

圖2 RT-PCR檢測MDA-MB-453細胞中SNHG3 mRNA表達與sh- NC組比較，*P<0.05；與oe-NC組比較，#P<0.05

2.SNHG3對MDA-MB-453細胞增殖的影響：與對照組比較，sh-NC組和oe-NC組細胞活力和克隆形成數比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與sh-NC組比較，sh- SNHG3組細胞活力和克隆形成數明顯降低(P<0.05)；與oe-NC組比較，oe- SNHG3組細胞活力和克隆形成數明顯升高(P<0.05，圖3)。

圖3 SNHG3對MDA-MB-453細胞增殖的影響A.CCK-8檢測MDA-MB-453細胞活力；B.克隆形成實驗檢測MDA-MB-453細胞增殖能力；與sh-NC組比較，*P<0.05；與oe-NC組比較，#P<0.05

3.SNHG3對MDA-MB-453細胞Hedgehog通路的影響：Western blot法檢測各組細胞中Gli1蛋白表達，與對照組比較，sh-NC組和oe-NC組細胞中Gli1蛋白表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與sh-NC組比較，sh- SNHG3組細胞中Gli1蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與oe-NC組比較，oe- SNHG3組細胞中Gli1蛋白表達明顯升高(P<0.05，圖4)。

圖4 Western blot法檢測SNHG3對MDA-MB-453細胞Hedgehog通路的影響與sh- NC組比較，*P<0.05；與oe-NC組比較，#P<0.05

4.cyclopamine對MDA-MB-453細胞Hedgehog通路的影響：20μmol/L和40μmol/L的 cyclopamine可明顯抑制細胞活力(P>0.05)，因此，后續實驗中cyclopamine的使用濃度為10μmol/L。與oe-NC組比較，oe- SNHG3組細胞中SNHG3 mRNA表達和Gli1蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與oe- SNHG3組比較，oe- SNHG3+cyclopamine組細胞中SNHG3 mRNA表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，Gli1蛋白表達明顯降低(P<0.05，圖5)。

圖5 cyclopamine對MDA-MB-453細胞Hedgehog通路的影響A.CCK-8檢測MDA-MB-453細胞活力；B.RT-PCR檢測MDA-MB-453細胞中SNHG3 mRNA表達；C.Western blot法檢測MDA-MB-453細胞中Gli1蛋白表達；與0μmol/L組比較，*P<0.05；與oe-NC組比較，#P<0.05；與oe- SNHG3組比較，ΔP<0.05

5.cyclopamine對MDA-MB-453細胞增殖的影響：與oe-NC組比較，oe- SNHG3組細胞活力和克隆形成數明顯升高(P<0.05)；與oe- SNHG3組比較，oe- SNHG3+cyclopamine組細胞活力和克隆形成數明顯降低(P<0.05，圖6)。

圖6 通路抑制劑cyclopamine對MDA-MB-453細胞增殖的影響A.CCK-8檢測MDA-MB-453細胞活力；B.克隆形成實驗檢測各組MDA-MB-453細胞增殖能力；與oe-NC組比較，*P<0.05；與oe- SNHG3組比較，#P<0.05

討 論

在世界范圍內，乳腺癌是影響女性的最常見癌癥，浸潤性導管癌是最常見的腫瘤亞型，其發生率呈逐年上升趨勢[9]。雖然隨著早期發現的普及和手術、化放療、內分泌治療及分子靶向藥物治療等綜合治療的開展，乳腺癌患者病死率有所下降，但仍有相當一部分患者無法從現有的治療模式中獲益，而最終出現復發轉移[10]。目前乳腺癌發生、發展的分子機制尚不明確，因此深入研究其機制，探索更多的靶點，對于乳腺癌的治療及降低復發率等具有重要的意義。

LncRNAs主要由RNA聚合酶Ⅱ轉錄，但不能翻譯成蛋白質[11]。研究表明，lncRNAs在多種生物學過程中發揮著重要作用，包括轉錄、翻譯和表觀遺傳學[12]。LncRNAs可作為腫瘤抑制基因和癌基因，影響細胞增殖、凋亡、分化、侵襲、遷移和免疫反應抑制等過程[13]。此外，lncRNAs可作為腫瘤早期診斷的分子標志物和腫瘤治療的新靶點[14]。SNHG3是一種致癌LncRNA[15]。目前的研究表明，SNHG3可通過多種機制促進癌癥的發生、發展和預后[16]。研究表明，SNHG3在乳腺癌組織中高表達。SNHG3通過激活Notch信號通路，促進乳腺癌細胞的增殖和轉移[17]。此外，敲低SNHG3通過miR-326/ITGA5軸和抑制Vav2/rac1信號通路抑制了三陰性乳腺癌細胞的惡性發展[18]。本研究結果顯示，敲低SNHG3可抑制乳腺癌細胞活力和克隆形成數，而過表達SNHG3可促進乳腺癌細胞活力和克隆形成數。該研究結果表明，SNHG3在乳腺癌中是一個促癌因子。

Hedgehog信號通路通過信號級聯發揮其生物學效應，最終導致膠質瘤相關癌基因(glioma-associated oncogene，Gli)轉錄因子激活型和抑制型之間的平衡改變[19]。Gli作為一種多功能轉錄因子，包括Gli1、Gli2和Gli3 3個成員，其中Gli1是轉錄激活因子[20]。在乳腺癌的相關研究中，Hedgehog信號通路的激活對乳腺癌的進展具有重要意義[21]。目前，已有證據顯示，LncRNA SNHG6通過激活Hedgehog信號通路促進膽囊癌細胞的上皮-間充質轉化、細胞增殖和侵襲[22]。目前雖無法證明SNHG3與Hedgehog信號通路的相關性，但Pandolfi等[23]研究發現在人類黑色素瘤中，E2F1與Patched1、Gli1和Gli2的表達顯著相關。E2F1是Hedgehog信號的重要介體，它是激活Hedgehog通路誘導黑色素瘤生長所必需的。Shi 等[24]通過實驗證明了E2F1可激活SNHG3，促進非小細胞肺癌細胞增殖和遷移。以上研究結果說明SNHG3和Hedgehog信號通路之間可能呈相關性。本研究結果顯示，敲低SNHG3可抑制乳腺癌細胞中Gli1的蛋白表達，而過表達SNHG3可促進乳腺癌細胞中Gli1的蛋白表達。進一步實驗結果顯示，在過表達SNHG3的乳腺癌細胞中，Hedgehog通路抑制劑cyclopamine可明顯抑制Gli1的蛋白表達，抑制細胞活力和克隆形成數。該研究結果表明，SNHG3通過激活Hedgehog通路在乳腺癌細胞中發揮促腫瘤作用。

綜上所述，敲低SNHG3通過抑制Hedgehog通路活化抑制乳腺癌細胞增殖，而過表達SNHG3通過激活Hedgehog通路促進乳腺癌細胞增殖。該研究結果為明確乳腺癌的發病機制及開發乳腺癌治療靶點提供了新的研究策略。