應(yīng)用外顯子測(cè)序技術(shù)芯片對(duì)妊娠期單基因致病型高血壓的研究

孫成娟 劉曉巍

妊娠期高血壓是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡的主要原因，妊娠期常用的降壓藥物為腎上腺受體阻滯劑(拉貝洛爾)、鈣離子拮抗劑(硝苯地平、尼卡地平)和α受體阻滯劑(酚妥拉明)等[1]。若血壓仍無法控制，短期內(nèi)迅速升高，發(fā)生高血壓急癥，必要時(shí)短期應(yīng)用硝普鈉降壓后醫(yī)源性終止妊娠，尤其是孕周<28周者，且這類胎兒存活率極低。單基因致病型高血壓是由單個(gè)基因突變直接引發(fā)的高血壓，常表現(xiàn)為難治性高血壓，服用3～4種降壓藥物而血壓仍不能達(dá)標(biāo)，并且靶器官損害嚴(yán)重，起病時(shí)間早，程度重，同時(shí)伴有較多并發(fā)癥。單基因致病型高血壓致病基因目前有17種，包括40余種亞型[2，3]。國際上研究單基因致病型高血壓多為男性患者或高血壓門診住院患者，而妊娠期進(jìn)行單基因致病型高血壓的發(fā)病情況的研究，目前國內(nèi)外少有報(bào)道[4,5]。隨著妊娠的進(jìn)展，心血管系統(tǒng)容量增加，增加了對(duì)孕婦合并癥的考驗(yàn)。而單基因致病型高血壓患者妊娠時(shí)，應(yīng)用妊娠期常用的降壓藥物治療無效。高血壓急癥可發(fā)生于有或沒有既往存在慢性高血壓病史的患者[6]。國外對(duì)絕大多數(shù)單基因致病性高血壓患者均進(jìn)行了致病基因的突變檢測(cè)，而國內(nèi)在這方面的工作亦初步開展。考慮到疾病的多樣性和致病基因突變的多樣性，本研究對(duì)符合納入標(biāo)準(zhǔn)的病例進(jìn)行臨床表型的觀察和相關(guān)基因的突變檢測(cè)，以期發(fā)現(xiàn)新的突變，加深對(duì)單基因致病型高血壓的認(rèn)識(shí)，并為臨床診治妊娠期高血壓疾病提供思路，并期望對(duì)既往有妊娠期高血壓急癥而導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局病史且有再孕要求患者明確病因，給予針對(duì)性藥物調(diào)整，改善妊娠預(yù)后。

資料與方法

1.研究對(duì)象:選取2015年8月～2017年6月在筆者醫(yī)院行產(chǎn)前檢查，有慢性高血壓病史且于妊娠32周內(nèi)因高血壓急癥終止妊娠的漢族孕婦31例為研究組，另選擇同期無高血壓家族史且無合并癥和并發(fā)癥的正常孕婦31例為對(duì)照組，均隨訪至分娩結(jié)束。高血壓急癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：血壓明顯升高[舒張壓達(dá)120～130mmHg，同時(shí)合并靶器官損害；或收縮壓≥220mmHg和(或)舒張壓≥140mmHg，無論有無癥狀][7]；或應(yīng)用鹽酸拉貝洛爾100mg，每8h口服1次，加用硝苯地平緩釋片口服及應(yīng)用拉貝洛爾靜脈泵入及尼卡地平等多種藥物靜脈泵入，仍無法控制血壓。排除多胎妊娠，排除因心力衰竭、腎功能不全、高血壓眼底改變終止妊娠者，排除應(yīng)用鹽酸拉貝洛爾配合硝苯地平緩釋片治療可控制血壓者。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

2.臨床和實(shí)驗(yàn)室資料獲得：通過查閱電子病歷或電話咨詢獲得，包括年齡、孕周、高血壓病程、身高、體重、基礎(chǔ)血壓、不同時(shí)期血鉀水平及分娩后的血壓。本實(shí)驗(yàn)在百世諾(北京)醫(yī)療科技有限公司進(jìn)行。

3.標(biāo)本取材及檢測(cè)內(nèi)容：抽取研究組終止妊娠時(shí)和正常孕婦妊娠32周時(shí)肘靜脈血5ml，加入到含有0.5ml 10%乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，立即提取基因組DNA。

4.基因組DNA的提取：使用QIAamp?DNA試劑盒(德國Qiagen公司)，參照標(biāo)準(zhǔn)操作方法提取血液中DNA。所有受檢樣本提取的DNA經(jīng)過檢測(cè)，吸光度(A)260/280為1.75～1.85，濃度>30ng/μl，質(zhì)量符合第2代測(cè)序要求，可以進(jìn)行建庫實(shí)驗(yàn)。

5.目標(biāo)基因芯片測(cè)序：使用液體處理自動(dòng)化設(shè)備(美國Perkin Elmer公司)修改基于溶液的Agilent SureSelect目標(biāo)富集系統(tǒng)(美國Agilent公司)制備文庫。將3μg基因組DNA隨機(jī)片段化至250bp的平均大小，片段末端修補(bǔ)，接頭連接，缺口修補(bǔ)純化，擴(kuò)增文庫。同時(shí)靶基因定位，第2次擴(kuò)增測(cè)序。31例制備好的樣本文庫和31例對(duì)照文庫均使用MiSeq Reagent Kits V2試劑盒(美國Illumina公司)參照標(biāo)準(zhǔn)方案上機(jī)，在MiSeq測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序。測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，對(duì)得到的測(cè)序結(jié)果完成質(zhì)量評(píng)估后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

6.單基因致病型高血壓不同外顯子復(fù)合芯片：基因包括NF1B、CLCNKB、BSND、SDHC、AGT、CYP17A1、MEN1、SDHD、KCNJ5、SCNN1A、SLC12A1、SCNN1G、HSD11B2、NF1、CUL3、NF2、PPARG、CASR、NR3C2、GDNF、NR3C1、CYP11B1、CLCNKA、SDHB、KCNJ10、REN、RET、SDHAF2、CCND1、KCNJ1、WNK1、MAX、SLC12A3、SCNN1B、ACE、WNK4、TMEM127、VHL、CACNA1D、AGTR1、SDHA、KLHL3、CYP21A2、KIF1B。

7.測(cè)序質(zhì)量評(píng)估：每個(gè)堿基的測(cè)序質(zhì)量值(Qphred值)是由公式Qphred=-10log10(e)轉(zhuǎn)化得到，其中Q30表示堿基正確識(shí)別率達(dá)到99.9%。本研究的測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量主要分布在Q30(≥90%)以上，這樣可以更好地保證后續(xù)分析的準(zhǔn)確性。使用去冗余后的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行覆蓋度、深度等統(tǒng)計(jì)。當(dāng)一個(gè)位點(diǎn)的堿基覆蓋深度達(dá)到150～100倍以上，并且該位點(diǎn)的突變頻率>20%，則認(rèn)為該位點(diǎn)處檢測(cè)出的單核苷酸多態(tài)性比較可信。

8.受檢樣本測(cè)序比對(duì)分析：本研究采用的參考基因組是Human GRCh37/hg19。使用BWA軟件將測(cè)序片段比對(duì)回參考基因組序列上，并使用Picard軟件去除測(cè)序序列中的重復(fù)。應(yīng)用Picard軟件去除聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增導(dǎo)致的重復(fù)序列后，應(yīng)用CLC Genomics Workbench軟件進(jìn)行序列對(duì)比和尋找基因差異。變異基因的檢測(cè)和定位致病變異。排除常見的基因多態(tài)性：等義突變，等位基因頻率≥1%(基于GO Exome序列基因計(jì)劃http:∥evs.gs.washington.edu，1000Genomes計(jì)劃http:∥www.1000genomes.org)；在正常人中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)；使用PolyPhen軟件和SIFT軟件預(yù)測(cè)基因多態(tài)性變異，前者評(píng)分越接近于1，后者評(píng)分<0.1被認(rèn)為變異致病性越強(qiáng)。然后使用4個(gè)在線突變致病性預(yù)測(cè)分析軟件Polyphen-2、SIFT、Mutation Taster和FATHMM對(duì)12個(gè)變異進(jìn)行生物信息學(xué)層面的突變致病性分析，得到每個(gè)變異的致病性預(yù)測(cè)。

結(jié) 果

31例高血壓急癥患者每個(gè)DNA樣本的堿基測(cè)序深度在45～160倍的范圍內(nèi)，10倍以上測(cè)序覆蓋度占比98.731%±0.508%。

考慮到高血壓急癥約占所有高血壓患者的1%～2%，且高血壓患者在所有人群中約占1/7，因此高血壓急癥在所有人群中占比約為2‰。在進(jìn)行變異篩選時(shí)，結(jié)合考慮該疾病可能的多基因致病特點(diǎn)，本研究將等位基因頻率大于1‰的變異過濾掉，因而保留31例患者中所有等位基因頻率低于1‰的變異。然后進(jìn)一步僅保留錯(cuò)義突變、移碼突變、無義突變、內(nèi)含子剪接位點(diǎn)突變，最終在11例患者中發(fā)現(xiàn)12個(gè)不同的基因變異，涉及10個(gè)不同基因。這12個(gè)變異的類型均為錯(cuò)義突變、雜合突變。通過查閱包括千人基因組和ExAC等外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)庫，本研究發(fā)現(xiàn)的12個(gè)變異中有7個(gè)變異的等位基因頻率在這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中均為0，表明這些變異非常罕見。然后使用4個(gè)在線突變致病性預(yù)測(cè)分析軟件Polyphen-2、SIFT、Mutation Taster和FATHMM對(duì)12個(gè)變異進(jìn)行生物信息學(xué)層面的突變致病性分析，得到每個(gè)變異的致病性預(yù)測(cè)(表1)。

表1 對(duì)高血壓急癥患者測(cè)序發(fā)現(xiàn)的罕見變異的生物信息學(xué)分析

涉及PPARG、NF1、KLHL 3個(gè)基因的4個(gè)變異被≥3個(gè)軟件預(yù)測(cè)為可能致病。特別是PPARG基因突變(c.1276C>G；p.P426A)同時(shí)被4個(gè)在線突變致病性分析軟件預(yù)測(cè)為致病性突變，且該位點(diǎn)突變的頻率極低，在ExAC數(shù)據(jù)庫的東亞人種外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)中尚未有該位點(diǎn)突變的記錄，以上均提示該基因突變很可能與導(dǎo)致高血壓急癥的致病突變相關(guān)。對(duì)致病突變進(jìn)行病例回顧及妊娠期化驗(yàn)檢查發(fā)現(xiàn)，4例患者的風(fēng)濕免疫化驗(yàn)結(jié)果均為陰性，不考慮由免疫系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的高血壓急癥，因高血壓急癥或胎兒宮內(nèi)窘迫(胎心型)以剖宮產(chǎn)終止妊娠，新生兒均存在胎兒生長(zhǎng)受限(表2)。

表2 具有致病突變的妊娠期單基因致病型高血壓患者的一般情況

討 論

大多數(shù)高血壓是行為和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，然而基因突變也被確定為原因之一。我國高血壓患者達(dá)2.43億，而難治性高血壓占10%～12%，其中繼發(fā)性高血壓占高血壓比例6%～12%。單基因高血壓是繼發(fā)性高血壓重要病因之一。目前已明確的單基因致病性高血壓有17種，其中包含40余種亞型。《單基因遺傳性心血管疾病基因診斷指南》中，根據(jù)受累基因的功能分為3類：①基因突變直接影響遠(yuǎn)端腎小管的遠(yuǎn)曲小管和(或)集合管細(xì)胞的鈉轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，增加水鈉吸收，包括Liddle′s綜合征、Gordon′s綜合征、類鹽皮質(zhì)激素增多癥和妊娠加重型高血壓；②基因突變導(dǎo)致腎上腺類固醇合成異常，進(jìn)而造成遠(yuǎn)端腎單位的鹽皮質(zhì)激素受體異常激活，遠(yuǎn)端腎小管鈉轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)，包括家族性醛固酮增多癥、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥和家族性糖皮質(zhì)激素抵抗綜合征等；③以嗜鉻細(xì)胞瘤等為代表的、在腫瘤綜合征基礎(chǔ)上合并了高血壓表現(xiàn)的各種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，包括嗜鉻細(xì)胞瘤/副神經(jīng)節(jié)瘤、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤、VHL綜合征、神經(jīng)纖維瘤病等[7，8]。

當(dāng)孕婦年齡≤40歲并應(yīng)用多種降壓藥物，血壓控制仍不滿意，臨床上除了考慮為子癇前期病情進(jìn)展，同時(shí)需要警惕是否存在單基因致病型高血壓。后者靶器官損害通常較嚴(yán)重，發(fā)病年齡輕，治療困難，常呈現(xiàn)家族聚集性發(fā)病，部分患者為散發(fā)性基因突變，其確診需基因檢測(cè)，而常見的各項(xiàng)臨床生化檢查只能作為輔助手段。這些致病基因主要與調(diào)節(jié)血壓的激素合成、代謝以及激素作用的靶細(xì)胞位點(diǎn)有關(guān)，集中在腎臟和腎上腺的相關(guān)細(xì)胞內(nèi)。而單基因致病型高血壓治療必須個(gè)性化治療，針對(duì)獨(dú)特的鹽皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素或交感神經(jīng)通路紊亂給予對(duì)癥治療。對(duì)于年齡<35歲的高血壓患者，一旦有高血壓家族遺傳史，且具有低血漿腎素活性特征時(shí)，應(yīng)考慮進(jìn)行基因篩查。基因篩查有助于早期病因診斷，行針對(duì)性的特異治療；并且能夠通過篩查直系親屬，發(fā)現(xiàn)攜帶突變的家庭成員，達(dá)到早期診斷、早期針對(duì)性治療和改善預(yù)后的目的[2]。目前尚未有妊娠期單基因致病型高血壓的相關(guān)研究。

本研究應(yīng)用外顯子測(cè)序技術(shù)芯片發(fā)現(xiàn)2例早發(fā)型重度子癇前期患者存在抑癌基因NF1突變(c.8093C>T，c.8345C>T)，而NF1突變導(dǎo)致神經(jīng)纖維瘤病1型是神經(jīng)纖維瘤病中最常見的類型，主要表型包括神經(jīng)纖維瘤、典型的牛奶咖啡斑的色素沉著、癲癇或智力障礙[9～11]。一項(xiàng)針對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)認(rèn)為，NF1基因可能與血管性疾病的發(fā)生存在因果關(guān)系[12]。本研究中雖然這2例早發(fā)性重度子癇前期患者存在NF1基因突變(c.8093C>T，c.8345C>T)，但無典型的臨床表型，故NF1基因的某些突變類型及突變基因產(chǎn)物的比例與臨床表型關(guān)系尚不清楚。NF1基因突變檢測(cè)結(jié)果為陽性并不能預(yù)測(cè)疾病的嚴(yán)重程度或并發(fā)癥。

既往研究表明，過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs，PPARG)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9 mRNA表達(dá)，阻礙胎盤雌激素和基質(zhì)金屬蛋白酶的合成分泌，可導(dǎo)致胎盤缺血缺氧，胎兒生長(zhǎng)受限[13]。本研究中1例既往因孕中期慢性高血壓和胎兒畸形引產(chǎn)的29歲孕婦，此次妊娠自早孕期血壓進(jìn)行性升高，伴有低鉀血癥，孕32周因?yàn)楦哐獕杭卑Y并發(fā)重度子癇前期行剖宮產(chǎn)終止妊娠，胎兒生長(zhǎng)受限；基因檢測(cè)為錯(cuò)義突變，c.1276C>G，氨基酸發(fā)生改變?yōu)閜.P426A，是PPARG1異構(gòu)體轉(zhuǎn)錄子4發(fā)生變異，與變異2在5′非翻譯區(qū)和5′編碼區(qū)有所不同。患者低鉀血癥推測(cè)可能由于PPARG基因突變，導(dǎo)致ATP敏感鉀通道活性增加引起，目前正在進(jìn)行家系驗(yàn)證中。

本研究發(fā)現(xiàn)1例慢性高血壓并發(fā)早發(fā)性高血壓患者KLHL3(Kelch-like 3)基因發(fā)生雜合突變，使堿基由G變?yōu)锳，氨基酸p.A38T發(fā)生改變。而KLHL3基因是引起以高血壓、高鉀血癥而腎小球?yàn)V過率正常為特征Gordon綜合征的重要組成基因之一。作為常染色體顯性遺傳疾病，Gordon綜合征發(fā)病基因包括WNK1(With-No-Lysine 1)、WNK4(With-No-Lysine 4)、CUL3(cullin-3)和KLHL3 4個(gè)基因。KLHL3/CUL3泛素連接酶可以降解WNK1、WNK4調(diào)節(jié)血壓[14,15]。KLHL3中成分的突變引起持續(xù)性腎臟鈉重吸收增加和鉀離子的分泌受損，導(dǎo)致高血壓和高鉀血癥。Ishizawa等[16]研究發(fā)現(xiàn)KLHL3泛素連接酶復(fù)合物參與低鉀介導(dǎo)的腎臟中Na-Cl協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的激活。本研究中發(fā)現(xiàn)1例KLHL3基因堿基由G變?yōu)锳，氨基酸p.A38T發(fā)生改變，考慮其代謝產(chǎn)物通過影響泛素連接酶，調(diào)整血管緊張素信號(hào)通路，并導(dǎo)致Na-Cl持續(xù)性重吸收，同時(shí)損害鉀離子的分泌。既往研究表明無論是KLHL3s433N還是KLHL3s433G的替代都可以導(dǎo)致高血壓和高鉀血癥，而氫氯噻嗪及限鈉飲食能夠有效糾正患者的電解質(zhì)紊亂和高血壓[17]。給予該患者氫氯噻嗪降壓和限鈉飲食治療后血壓控制理想，并囑其避免口服高鹽、高鉀食物。

綜上所述，本研究應(yīng)用外顯子測(cè)序技術(shù)芯片對(duì)妊娠期單基因致病型高血壓進(jìn)行研究，以亞洲人群的頻率<0.001為標(biāo)準(zhǔn)，在11例患者中發(fā)現(xiàn)12個(gè)不同的基因變異，均為錯(cuò)義突變、雜合突變。突變致病型預(yù)測(cè)分析軟件發(fā)現(xiàn)PPARG、NF1、KLHL 3個(gè)基因的4個(gè)DNA變異可能與疾病相關(guān)。其中PPARG基因突變(c.1276C>G)位點(diǎn)突變頻率極低，在ExAC數(shù)據(jù)庫中未有該位點(diǎn)突變記錄。本研究單基因致病型高血壓發(fā)生率明顯高于文獻(xiàn)報(bào)道率，考慮與筆者醫(yī)院為全國孕產(chǎn)婦危重癥搶救中心，病情危重的妊娠期高血壓病例集中有關(guān)，且此項(xiàng)研究應(yīng)用外顯子測(cè)序技術(shù)芯片的基因檢測(cè)，診斷明確。

對(duì)于妊娠期高血壓疾病，目前臨床上強(qiáng)調(diào)的主要是妊娠期血壓監(jiān)測(cè)，但對(duì)既往有高血壓不良孕產(chǎn)史患者的隨訪及再次妊娠患者的指導(dǎo)目前還欠缺。目前有相當(dāng)數(shù)量妊娠期高血壓急癥患者或者既往因血壓高，應(yīng)用多種降壓藥物無法控制血壓，不得不在孕中晚期終止妊娠患者，無法期待至胎兒存活且早產(chǎn)兒常合并胎兒生長(zhǎng)受限或各系統(tǒng)發(fā)育不完善而預(yù)后欠佳者，有迫切的再次生育的要求。應(yīng)對(duì)此類患者進(jìn)行病因診斷、完善免疫系統(tǒng)疾病、機(jī)體是否存在血液高凝狀態(tài)的同時(shí)，應(yīng)用外顯子測(cè)序技術(shù)芯片進(jìn)行基因診斷，明確是否存在單基因致病型高血壓。這將有助于進(jìn)一步闡明妊娠期高血壓疾病發(fā)生的分子機(jī)制，可為妊娠期高血壓急癥的防治提供新思路，為妊娠期急進(jìn)型高血壓治療尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)，一方面可以明確病因，給予用藥指導(dǎo)；另一方面可以提前預(yù)防，改善妊娠結(jié)局。這對(duì)母嬰近遠(yuǎn)期合并癥的預(yù)防、提高人口素質(zhì)具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。