清熱化瘀方對缺血再灌注大鼠腦組織的保護效應及機制

秦紅玲 胡躍強 農必華 陳 煒 程 越 盧健鋒 譚璐璐

腦動脈栓塞引起的缺血性腦卒中(ischemic stroke, IS)占所有腦卒中疾病的60%～80%，可造成局部血液供應紊亂，導致高發生率和高病死率[1]。溶栓或手術以盡早恢復血流是治療IS的主要策略，但該過程常導致腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)損傷[2]。清熱化瘀方是治療IS的中藥復方，臨床療效確切，具有抗氧化、抗凋亡及抗炎作用，可有效改善大鼠腦I/R損傷[3～5]，但其作用機制尚不明確。大量研究證實，microRNA(miRNA)參與調控腦I/R損傷機制，可能是該病治療的新靶點[6]。筆者預實驗發現，miR-503-5p在清熱化瘀方治療腦I/R大鼠前、后存在差異表達。查閱文獻發現，miR-503-5p可通過靶向抗凋亡因子Bcl-2，進而誘導內皮細胞凋亡[7]。提示清熱化瘀方可能通過調控miR-503-5p/Bcl-2通路，進而發揮抗凋亡作用。故本研究以腦I/R大鼠為研究對象，基于miR-503-5p/Bcl-2通路介導的細胞凋亡機制，進一步探究清熱化瘀方對腦I/R大鼠腦組織損傷的保護效應及機制，為清熱化瘀方的臨床應用提供更多的依據。

材料與方法

1.材料：SD大鼠(合格證號：SCXK2016-0005)由廣西醫科大學實驗動物中心提供。清熱化瘀方(共9味中藥：水牛角30g、丹參15g、赤芍15g、地龍10g、石菖蒲10g、川芎10g、郁金10g、酒大黃6g、天竺黃10g)由江陰天江藥業有限公司制備(批號：0904099)。Trizol、RIPA裂解液、BCA試劑盒購自北京Solarbio公司。反轉錄試劑盒、real-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。miScript反轉錄試劑盒購自德國Qiagen公司?？贵wBcl-2、Bax購自美國BioVision公司。抗體caspase-3、caspase-8、caspase-9、β-actin、山羊抗兔二抗HRP-IgG和TUNEL染色試劑盒購自英國Abcam公司。

2.動物分組及處理：SD大鼠，體質量300～400g，16～20周齡，分為正常組、假手術組、模型組、清熱化瘀方組，每組10只。除正常組外，其余各組均采用線栓法進行處理。清熱化瘀方組灌胃清熱化瘀方劑[1.4毫升/(100克·次)]，每天2次，其濃度及等效劑量按體表面積折算。正常組、假手術組和模型組均灌胃等體積0.9% NaCl溶液。各組大鼠均正常飼養，自由飲水，4天后處死取缺血灶周圍腦組織進項各項檢測分析。動物實驗均符合動物倫理要求。

3.動物模型建立：采用大鼠大腦中動脈梗阻(MCAO)模型，參照Longa線栓法進行[8]。模型建立具體步驟：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，平臥固定于手術臺，頸部術區備皮、消毒，于旁正中切開長2～4cm切口，鈍性分離肌肉，暴露術野，分離頸總、頸外和頸內動脈，近心端結扎頸總動脈并于動脈下備線，用動脈夾夾閉頸內動脈，用留置針刺破頸總動脈使血流入留置針內，撤掉留置針，將尼龍線栓插入刺破的頸總動脈孔，并用彎頭眼科鑷將線栓經頸內動脈進入顱內推送至大腦中動脈起始處(進線18～20mm可感覺到阻力)，阻斷大腦中動脈血流，缺血2h后去除線栓再灌注，縫合切口。假手術組線栓只進入頸內動脈9mm，不栓塞大腦中動脈，去除線栓縫合切口。

4.TUNEL染色：取各組大鼠腦組織常規脫水固定，石蠟包埋，切片。按TUNEL染色試劑盒說明書操作。在400倍顯微鏡下，于缺血灶腦組織邊緣隨機選取視野，觀察切片中TUNEL陽性細胞數(細胞核為棕色)，凋亡陽性率(%)=單位面積內凋亡細胞數/細胞總數×100%。

5.應用RT-qPCR法檢測：采用Trizol法提取各組細胞總RNA，進行反轉錄及實時熒光定量PCR反應，按操作說明書進行。PCR程序：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火34s，40個循環。引物由華大基因合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

6.Western blot法檢測：RIPA裂解液裂解組織提取總蛋白，BCA法定量后，取80μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜后用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉2h，分別孵育相應蛋白一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜10min×4次，室溫孵育HRP標記二抗2h，TBST振搖洗膜10min×4次。ECL試劑發光后用凝膠成像儀拍照，Image J軟件計算條帶灰度值。

結 果

1.清熱化瘀方對缺血再灌注大鼠腦組織細胞凋亡的影響(圖1)：采用TUNEL染色檢測腦組織細胞凋亡情況，與正常組比較，模型組缺血灶腦組織凋亡細胞數明顯增多，凋亡率顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，清熱化瘀方組缺血灶腦組織凋亡細胞數明顯減少，凋亡率顯著降低(P<0.05)，假手術組與正常組的檢測結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 TUNEL染色(×400)A.正常組；B.假手術組；C.模型組；D.清熱化瘀方組。與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.清熱化瘀方對大鼠腦組織Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-8及caspase-9表達的影響：詳見表2、表3、圖2。采用RT-qPCR和Western blot法檢測凋亡相關因子的表達，結果顯示，與正常組比較，模型組缺血灶腦組織中Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平顯著降低，Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA和蛋白表達水顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，清熱化瘀方組缺血灶腦組織中Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平顯著升高，Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA和蛋白表達水顯著降低(P<0.05)。假手術組與正常組的檢測結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 大鼠腦組織中凋亡標志蛋白的Western blot法檢測結果

表2 各組大鼠腦組織凋亡標志物mRNA的相對表達

表3 各組大鼠腦組織凋亡標志蛋白的相對表達

3.清熱化瘀方對缺血再灌注大鼠腦組織miR-503-5p表達的影響：RT-qPCR檢測結果顯示，與正常組比較，模型組缺血灶腦組織中miR-503-5p表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，清熱化瘀方組缺血灶腦組織中miR-503-5p表達水平顯著降低(P<0.05)。假手術組與正常組miR-503-5p表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖3。

圖3 清熱化瘀方對缺血再灌注大鼠腦組織miR-503-5p表達的影響與正常組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05

討 論

腦I/R損傷的細胞和分子機制復雜，包括鈣離子超載、活性氧暴發、炎癥、血-腦脊液屏障破壞、凋亡基因的激活等，這些惡性循環最終導致細胞凋亡或壞死[9～12]。其中，細胞凋亡被認為是腦缺血損傷的關鍵事件[13,14]。caspase家族是調控細胞凋亡過程的關鍵執行者。經典細胞凋亡的激活主要通過兩條途徑進行。其中一種是外源性途徑，其通過激活細胞表面的死亡受體(如Fas)而啟動，導致caspase-8或caspase-10的激活。另一種途徑是內源性途徑，也稱為線粒體凋亡途徑，其起源于細胞色素C的線粒體釋放和相應的caspase-9的活化。這兩種途徑均導致信號級聯反應，集中于caspase-3的激活，最終導致細胞凋亡。此外，抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax是目前已知在凋亡過程中的關鍵標志物[15]。Bax通常與Bcl-2保持平衡，參與調控線粒體膜的通透性，控制細胞色素C的釋放和caspase家族的活化[16]。本研究發現，大鼠腦I/R損傷后缺血灶凋亡細胞數明顯增多，Bcl-2表達降低，Bax、caspase-3、caspase-8和caspase-9表達升高，符合腦I/R損傷后神經元凋亡機制，提示上調抗凋亡基因的表達，并抑制促凋亡途徑激活，是減輕腦I/R損傷的關鍵。

miRNA是一類高度保守、單股的非編碼小RNA，約有20～30個核苷酸，主要通過與目標mRNA的3′ UTR結合，導致mRNA降解或翻譯抑制[17]。并且，miRNA在IS的炎癥、氧化應激和凋亡中均發揮著重要的調控作用[18]。提示miRNA有望成為腦缺血診斷和預后的潛在生物學標志物以及治療靶標。研究發現，血清miR-503-5p在IS合并糖尿病患者急性期呈高水平，是預示腦卒中嚴重程度和短期預后的潛在標志物[19]。另外，在高糖刺激的人臍靜脈內皮細胞和2型糖尿病大鼠的心肌微血管內皮細胞中，miR-503-5p的水平明顯升高[20, 21]。miR-503-5p可通過靶向抑制Bcl-2的表達，進而誘導人肺微血管內皮細胞凋亡[7]。最新研究表明，miR-503-5p是IS的獨立危險因素，IS患者血漿miR-503-5p在急性期、重癥及LAA、TACI亞型中明顯升高，miR-503-5p拮抗劑可部分抑制永久性MCAO小鼠腦血管內皮細胞凋亡和ROS生成，腦血管內皮細胞體外實驗證實敲除miR-503-5p可上調Bcl-2的表達，進一步提示miR-503-5p/Bcl-2通路在腦I/R損傷中起關鍵作用[22]。本研究通過檢測大鼠腦I/R損傷后缺血灶miR-503-5p的表達，發現缺血組織中miR-503-5p表達顯著高于正常腦組織，同時伴隨著Bcl-2的低表達，證實miR-503-5p參與了腦I/R損傷過程并起著促凋亡的作用，且作用機制與Bcl-2介導的細胞凋亡機制有關。

如何減少腦I/R損傷一直是醫學界關注的問題。中醫認為，IS屬“中風”范疇，其病因病機多以“風、火、痰、瘀、虛、毒”為主[23]。根據王永炎院士提出的“毒損腦絡”觀點，研制清熱化瘀方治療IS，并取得了良好的臨床效果。前期研究已證實，清熱化瘀方具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，還可有效降低過度自噬，清除自由基，促進缺血半暗帶區的血管新生，減輕腦I/R損傷，保護神經元。然而，清熱化瘀方改善腦I/R損傷的作用機制尚未完全闡明。研究表明，缺血核心內的血流減少伴隨著不可逆的神經細胞壞死，而缺血半暗帶內出現的細胞凋亡在缺血后數小時內可逆，因此抑制細胞凋亡是治療腦卒中的重要策略[15]。本研究在前期研究基礎上，進一步探究清熱化瘀方的抗凋亡機制。結果發現，腦I/R大鼠經清熱化瘀方治療后，腦缺血組織中Bcl-2表達顯著升高，miR-503-5p、Bax、caspase-3、caspase-9表達及腦組織凋亡率均顯著降低，表明清熱化瘀方的抗凋亡機制與miR-503-5p/Bcl-2通路有關，其可能通過下調神經元miR-503-5p的表達，促進Bcl-2表達，從而抑制細胞色素C的釋放和caspase家族的激活，進而改善腦I/R損傷，保護神經元。

綜上所述，細胞凋亡是加速腦I/R損傷的關鍵因素。本研究結果表明，清熱化瘀方可抑制腦I/R大鼠腦組織細胞凋亡，且機制可能與抑制miR-503-5p、Bax及caspase家族表達、上調Bcl-2表達有關，進一步證實清熱化瘀方可有效減輕腦I/R損傷，發揮神經元保護效應，具有一定的臨床應用價值。