星形細胞瘤生存預后相關miRNA-mRNA調控關系對篩選

牛曉辰，高 艾，吉 澤，曹靈杰，蘇龍龍，王昕苑

(山西醫科大學，太原 030000)

星形細胞瘤(Astrocytoma)起源于星形膠質細胞，是顱內最常見的腫瘤，約占神經上皮組織腫瘤的70%以上。WHO分級為Ⅰ～Ⅱ級(低級別膠質瘤，LGG)與Ⅲ～Ⅳ級(膠質母細胞瘤，GBM)。該類腫瘤惡性程度高，預后較差，具有侵襲性生長的特點，手術難以全切且易復發，治療非常困難，有效抑制星形細胞瘤的發生發展成為腫瘤生物治療的難點之一[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類廣泛存在于動植物體內的短鏈非編碼RNA，僅有21～23個核苷酸序列，通過抑制翻譯或促進細胞質中mRNA降解來控制轉錄后的基因表達[3]。研究表明，miRNA在腫瘤的生長發育、信號轉導、細胞分化、增殖和能量代謝等進程中都發揮重要作用[4]。但有關miRNA與星形細胞瘤治療的研究報道較少，本研究利用GEO數據庫中有關星形細胞瘤的miRNA與mRNA兩個表達數據集，通過生物信息學手段篩選與星形細胞瘤患者生存預后相關的miRNA-mRNA調控關系對，為該類腫瘤的基礎研究與臨床治療提供重要靶點和參考。

1 材料與方法

1.1 檢索策略與芯片數據

以“astrocytoma”或“glioma”與“miRNA”或“mRNA”為檢索詞在美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的基因表達綜合數據庫(Gene Expression Omnibus，GEO)檢索芯片數據，共檢索到5個符合要求的miRNA數據集(分別是GSE103228、GSE90603、GSE25631、GSE65626和GSE138764)與15個mRNA數據集(分別是GSE1993、GSE4271、GSE4412、GSE7696、GSE8692、GSE16011、GSE19728、GSE21354、GSE24072、GSE45921、GSE103227、GSE90598、GSE25630、GSE65626和GSE138999)。綜合考慮樣本數量、信息完整度與可靠性，下載miRNA表達數據集GSE138764，包含有9例正常腦組織樣本和33例星形細胞瘤樣本的miRNA測序信息，檢測平臺為GPL18402 Agilent-046064 Unrestricted_Human_miRNA_V19.0_Microarray (miRNA ID version)。下載mRNA表達數據集GSE19728，包含有4例正常腦組織樣本和17例星形細胞瘤樣本的mRNA測序信息，檢測平臺為GPL570 [HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2 數據處理與差異分析

利用GPL注釋文件將miRNA和mRNA的ID轉換為基因名字，利用perl(perl 5.30.2)語言將測序數據分為正常組和腫瘤組。下載R(R 3.6.3)語言中的limma包，其中的avereps函數進行數據矯正，normalizeBetweenArrays函數用于標準化處理，得到可進行差異分析的表達矩陣。設置FDR(BH)法矯正后的閾值P.adj<0.05，|2FC|>2，進行差異分析，下載pheatmap包進行層次聚類分析并繪制差異基因熱圖和火山圖。

1.3 靶基因預測與調控網絡構建

利用miRWalk3.0網頁工具(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)整合2個miRNA靶基因預測數據庫TargetScan(http://www.targetscan,org/vert_72/)和miRDB(http://www.mirdb.org/cgi-bin/search.cgi)對GSE138764數據集中差異表達的miRNA進行靶基因預測。將預測到的靶基因與GSE19728差異表達的mRNA取交集，根據miRNA靶基因預測結果，明確取交集后的mRNA與miRNA之間的調控關系，整理出miRNA-mRNA關系對。將數據導入到Cytoscape 3.7.2軟件中，構建miRNA-mRNA調控網絡圖。

1.4 mRNA數據驗證與生存分析

利用GEPIA2.0網頁工具(http://gepia2.cancer-pku.cn/)輸出網絡中mRNA在LGG與GBM兩類腫瘤及其正常組織的表達量統計圖(設置P.adj<0.01，|2FC|>1，Match TCGA normal and GTEx data)，進而驗證其在正常組織和腫瘤組織中的差異表達情況。篩選與網絡中表達情況一致的mRNA，分別在LGG與GBM中進行生存分析，判斷mRNA高低表達與生存率之間的關系(設置Log rankP<0.05)，分為“高表達，生存率高”、“低表達，生存率高”與“無明顯差異”三種情況。

1.5 miRNA-mRNA調控關系對篩選

篩選LGG與GBM中“高表達，生存率高”與“低表達，生存率高”的mRNA，利用miRNA-mRNA調控網絡圖確定相應的miRNA，使用OncoLnc工具(http://www.oncolnc.org/)判斷miRNA高低表達與LGG或GBM患者生存率之間的關系(設置Log rankP<0.05，截斷值：25%)。根據miRNA對mRNA的功能發揮抑制作用這一生物學基礎，我們制定關鍵miRNA-mRNA調控關系對篩選標準：即“高表達，生存率高”的mRNA對應的miRNA在同類型腫瘤中，應符合“低表達，生存率高”；“低表達，生存率高”的mRNA對應的miRNA在同類型腫瘤中，應符合“高表達，生存率高”。這些miRNA-mRNA調控關系對具有重要生物學意義，可為星形細胞瘤的研究與治療提供重要靶點。

2 結果分析

2.1 差異表達miRNA和mRNA

GSE138764數據集中星形細胞瘤與正常組織樣本相比，差異表達的miRNA有90個(表達上調22個，下調68個)，差異基因熱圖(見圖1)，火山圖(見圖2)(圖中紅色代表表達上調，綠色代表下調，黑色代表無明顯差異)。GSE19728數據集中星形細胞瘤與正常組織樣本相比，差異表達的mRNA有644個(表達下調476個，上調168個)。

圖1 差異表達的miRNA基因熱圖Fig.1 Heat map of differentially expressed miRNA

圖2 差異表達的miRNA火山圖Fig.2 Volcano plot of differentially expressed miRNA

2.2 靶基因預測與調控網絡構建

利用miRWalk3.0網頁工具對90個差異表達的miRNA進行靶基因預測，TargetScan與miRDB數據庫共預測到1 668個靶基因，與GSE19728數據集中644個差異表達的mRNA取交集得到20個mRNA，根據miRNA靶基因預測結果，明確20個mRNA與miRNA之間的調控關系，整理出miRNA-mRNA關系對30個(見表1)，繪制調控網絡圖(見圖3)(網絡中紅色代表表達上調，綠色代表下調；三角形代表miRNA，橢圓形代表mRNA)。

圖3 miRNA-mRNA調控網絡圖Fig.3 miRNA-mRNA regulatory network diagram

表1 miRNA-mRNA調控關系Table 1 miRNA-mRNA regulatory pairs

2.3 mRNA數據驗證與生存分析

為了驗證網絡中20個mRNA在正常和腫瘤組織中的差異表達情況，利用GEPIA2.0網頁工具分析其在癌癥基因組圖譜數據庫(The Cancer Genome Atlas, TCGA, https://portal.gdc.cancer.gov/)中LGG與GBM兩類腫瘤的表達情況，符合統計學差異的mRNA有16個，分別是ANO3、CAMK2A、GABRA1、MAL2、SLC17A6、CALB1、GABRB2、SLITRK4、ZNF385B、SAMD12、PTPRR、BHLHE22、TBR1、ATP8A2、ST8SIA3和MYRIP，它們在腫瘤組織中均表達下調，且與調控網絡中的表達情況一致(見圖4)圖中紅色代表腫瘤組織，黑色代表正常組織)。

圖4 mRNA差異表達情況Fig.4 mRNA differential expressions

分別在LGG與GBM中對16個mRNA進行生存分析，其中9個mRNA在LGG中符合“高表達，生存率高”,分別是ANO3、GABRA1、MAL2、SLC17A6、CALB1、GABRB2、PTPRR、ATP8A2和ST8SIA3(見圖5)，7個mRNA在LGG中符合“無明顯差異”；而16個mRNA在GBM中均“無明顯差異”。

圖5 mRNA生存分析曲線Fig.5 mRNA survival analysis curves

2.4 miRNA-mRNA調控關系對

結果2.3中得到的9個有統計學意義的mRNA均在LGG中符合“高表達，生存率高”這一情況，根據結果2.2中的調控網絡確定其對應的miRNA，利用OncoLnc工具判斷對應miRNA高低表達與LGG患者生存率之間的關系。依據miRNA-mRNA調控關系對篩選標準，應篩選在LGG中符合“低表達，生存率高”的miRNA，共得到5個miRNA，分別是hsa-miR-424-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-193a-3p和hsa-miR-10b-5p，生存曲線(見圖6)。而其余miRNA的高低表達均與患者的生存率之間無明顯差異，據此共篩選到miRNA-mRNA調控關系對7個，為后續研究提供參考(見表2)。

表2 生存預后相關miRNA-mRNA調控關系對Table 2 miRNA-mRNA regulatory pairs associated with survival and prognosis

圖6 miRNA生存分析曲線Fig.6 miRNA survival analysis curves

3 討 論

成熟的miRNA通過堿基互補配對方式識別靶基因mRNA，發揮降解作用或直接阻斷翻譯過程[5]。目前已經有2 000多個miRNA被證實可在人體表達并參與調控30%的基因[6]。更重要的是，大量研究表明miRNA幾乎參與腫瘤發生進展的全過程，包括持續增殖、無限復制、回避生長抑制、抵抗凋亡、血管生成以及腫瘤微環境構建等，在不同類型腫瘤中通過作用于特定的靶基因mRNA，發揮抑癌或促癌作用[7]。而隨著細胞外泌體技術的發展，人為調控細胞內miRNA表達成為一種可能，這為精準治療疾病提供了廣闊的應用前景。細胞外泌體是幾乎所有類型的細胞以胞吐方式分泌到細胞外的胞外囊泡，由40～100 nm的脂質雙分子層構成，內含核酸或蛋白質分子，發揮細胞間信息交流作用[8]。將腫瘤細胞分泌的外泌體改造成高效的運載體，攜帶目標miRNA的類似物或抑制劑，回輸后利用人體精準的通訊系統，可實現miRNA的精確調控，有望成為腫瘤生物治療的重要工具[9]。本研究所篩選到的7個mRNA在LGG中均低表達，相應miRNA在LGG中高表達；生存分析則表明上述mRNA高表達，相應miRNA低表達，患者具有更高的生存率。因此利用外泌體技術特異性抑制這些miRNA表達，進而提高mRNA的翻譯水平，有望成為該類腫瘤生物治療的有效手段，但具體機制及可行性有待進一步研究。

本研究篩選到的7個mRNA有：ANO3、GABRA1、GABRB2、MAL2、CALB1、PTPRR和ST8SIA3。ANO3(Anoctamin 3)是鈣離子激活氯離子通道蛋白家族成員之一，對該基因的功能知之甚少，但該基因的突變與一些常染色體顯性顱頸肌張力障礙有關[10]。而該基因突變個體的細胞表現出內質網依賴性鈣信號的異常[11]，提示該基因可通過調節鈣信號相關通路影響LGG的發生發展。GABRA1(Gamma-aminobutyric acid type A receptor subunit alpha 1)和GABRB2(Gamma-aminobutyric acid type A receptor subunit beta2)分別是γ-氨基丁酸A型受體α1亞基和γ-氨基丁酸A型受體β2亞基，它們均參與γ-氨基丁酸受體的形成。γ-氨基丁酸是哺乳動物大腦中主要的抑制性神經遞質，作用于γ-氨基丁酸受體，該受體是配體門控氯離子通道，與癲癇的發生發展密切相關[12]。研究表明，γ-氨基丁酸相關受體的低表達與膠質瘤患者繼發性癲癇呈正相關關系[13]，因此提高該類受體表達可能減輕患者癲癇的發作，改善其生活質量與生存情況。MAL2(T cell differentiation protein 2)即T細胞分化蛋白2，該基因編碼屬于MAL蛋白脂類家族的多跨膜蛋白。該蛋白是脂質筏的組成部分，在極化細胞中，它主要定位于頂端膜下的內體結構，用于將膜結合蛋白和外源性物質從基底外側轉運至根尖表面[14]。研究表明，MAL2表達升高，可通過調節乳腺癌細胞系上皮-間充質轉化促進其增殖、遷移和侵襲[15]；而在結直腸癌中MAL2的高表達與患者的不良生存預后密切相關[16]；miR-129通過靶向MAL2，下調其表達水平，進而調控甲狀腺乳頭狀癌的生長和侵襲[17]。上述研究表明，MAL2參與多種腫瘤的進程，且該基因的低表達，會導致患者更高的生存率，這與我們在LGG中得到的結論相左，因此針對MAL2與LGG發生進展之間的關系，仍有待進一步的研究。CALB1(Calbindin 1)是鈣結合蛋白超家族的成員，它被認為是緩沖鈣離子進入刺激谷氨酸受體，在亨廷頓舞蹈病患者中這種蛋白常缺失[18]。研究表明，過表達CALB1通過調節p21和p27的表達水平，促進卵巢癌細胞增殖和集落形成，抑制細胞衰老[19]；在非小細胞肺癌中miR-454-3p通過下調CALB1水平可抑制細胞增殖[20]。這提示我們，CALB1在多種腫瘤中可能發揮癌基因的作用，但由于谷氨酸受體主要存在于腦內，該受體與膠質瘤之間存在密切關系，研究表明，加入該受體的拮抗劑后，可抑制膠質瘤細胞的侵襲生長[21]，而CALB1同樣可以延緩谷氨酸受體的激活，因此我們猜想該基因在LGG中可能發揮抑癌作用，但有待進一步考證。PTPRR(Protein tyrosine phosphatase receptor type R)即蛋白質酪氨酸磷酸酶R型受體，是蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的一員。PTPs被認為是調控多種細胞過程的信號分子，包括細胞生長、分化、有絲分裂周期和致癌轉化，在結直腸癌發生的早期該基因即被沉默[22]，過表達PTPRR能否抑制癌細胞的轉化，值得進一步研究。ST8SIA3(ST8 alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 3)是唾液酸轉移酶家族成員，該基因在腦組織中高表達，通過唾液酸化(蛋白質糖基化的一種)可改變細胞膜糖蛋白和糖脂的唾液酸化糖基化的結構和功能，進而影響細胞的生物學行為[23]。隨著蛋白質組學的發展，對于蛋白質翻譯后修飾的調控逐漸成為關注的熱點，唾液酸轉移酶家族成員的高表達，廣泛參與結直腸癌與非小細胞肺癌等的生長與侵襲過程[24-25]。但由于腫瘤細胞之間的異質性較強，同一修飾過程在不同腫瘤之間往往發揮不同作用，ST8SIA3在腦內的高表達，提示我們該基因以及唾液酸糖基化修飾與LGG之間的關系具有較高研究價值。

綜上所述，本研究共篩選到7個與LGG患者生存預后顯著相關的miRNA-mRNA調控關系對，為低級別膠質瘤的研究與治療提供靶點和參考方向。不足之處在于，未對7個miRNA-mRNA的調控關系進行驗證，它們之間是否存在靶關系需利用雙熒光素酶報告實驗等進行確定；GSE19728數據集中包含的正常組織樣品較少，但所得結果在TCGA數據庫中進一步得到了驗證，以保證數據的準確性；所使用的miRNA與mRNA數據集中腫瘤樣本并非來自同一組病人，導致說服力降低，如利用本研究思路對其他癌種進行研究，應注意樣本的選擇；所篩選的miRNA-mRNA調控關系對均與LGG患者生存預后相關，未在GBM中找到合適的關系對，提示后續研究應選擇GBM來源的腫瘤樣本進行分析。

4 結 論

1) 利用GEO數據庫中GSE138764篩選到星形細胞瘤組織相較正常組織差異表達的miRNA 90個(表達上調22個，下調68個)；利用GSE19728篩選到差異表達的mRNA 644個(表達下調476個，上調168個)；通過miRNA靶基因預測，成功構建星形細胞瘤中miRNA-mRNA調控網絡。

2) 對網絡中的mRNA進行生存分析，篩選到9個mRNA在LGG中符合“高表達，生存率高”；對相應的miRNA進行生存分析，篩選到5個miRNA在LGG中符合“低表達，生存率高”；據此共篩選到miRNA-mRNA調控關系對7個，為后續研究提供參考。

致 謝

感謝中南大學臨床藥理研究所劉昭前老師課題組提供的星形細胞瘤miRNA芯片數據集GSE138764對本研究的幫助；感謝中國人民解放軍第150中心醫院姚志強老師課題組提供的星形細胞瘤mRNA芯片數據集GSE19728對本研究的幫助；感謝山西省2019年大學生創新創業訓練計劃項目(No.2019189)對本課題的資助。