肝細胞癌患者自噬相關(guān)基因的預(yù)后作用

桂子瑋，李 艷，王昕苑，韓佳奇，姚詩琪，牛曉辰*

(1. 山西醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030000；2. 山西醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，太原 030000；3.山西醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030000)

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是原發(fā)于肝臟的上皮性惡性腫瘤，約占原發(fā)性肝癌的90%以上[1]。2018年我國HCC患者新增39.3萬例，死亡36.9萬例，是中國癌癥死亡的第二大原因[2-3]。由于HCC發(fā)病較為隱匿，大多數(shù)患者就診時已是晚期，對其生存預(yù)后的評估主要依靠臨床有創(chuàng)性檢查，即TNM分期系統(tǒng)。其主要缺點為T期根據(jù)原發(fā)腫瘤的大小來劃分，未能反映原發(fā)灶的厚度對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響，并且由于HCC高度的異質(zhì)性，分期系統(tǒng)的預(yù)測準確性降低，不足以精確評估HCC患者的預(yù)后情況，急需新的預(yù)后標志物指導(dǎo)HCC患者的個體化治療。自噬是依賴溶酶體系統(tǒng)對損傷或無用的細胞器與蛋白質(zhì)等進行降解的一種途徑，產(chǎn)生的能量可供應(yīng)細胞存活和細胞器的更新[4]。近年來自噬與腫瘤之間的關(guān)系受到廣泛關(guān)注，一方面自噬在血管生成較少的腫瘤中心部位發(fā)揮促進腫瘤形成的作用[5]；另一方面自噬通過減少受損或無用的細胞器與蛋白質(zhì)的積累，限制氧化應(yīng)激等過程，從而抑制癌癥的發(fā)生[6]。自噬與HCC的研究表明，自噬廣泛參與該腫瘤的發(fā)生與侵襲性生長[7-9]，其可通過激活Wnt /β-catenin信號傳導(dǎo)來誘導(dǎo)MCT1表達，從而促進HCC細胞的轉(zhuǎn)移和糖酵解；不同的腫瘤微環(huán)境中，通過腫瘤和免疫成分的協(xié)同作用可調(diào)節(jié)癌細胞自噬，從而誘導(dǎo)炎性單核細胞促進HCC的發(fā)生。

由于自噬與腫瘤的相互作用受到許多自噬相關(guān)基因(ATGs)的調(diào)控，瘤組織中ATGs的表達情況可以用來評估患者的生存預(yù)后，相關(guān)研究已在非小細胞肺癌、多形性膠質(zhì)母細胞瘤以及腎透明細胞癌等報道[10-12]。因此，構(gòu)建包含有多個ATGs的風(fēng)險評分模型來預(yù)測HCC患者的生存預(yù)后，既可填補該方法在HCC中的研究空白，又能實現(xiàn)對HCC患者更精準的預(yù)后評估，為其個性化治療提供重要參考。本研究聯(lián)合TCGA數(shù)據(jù)庫與人類自噬基因數(shù)據(jù)庫，通過構(gòu)建自噬相關(guān)基因的預(yù)后模型預(yù)測HCC患者的生存預(yù)后情況，為相關(guān)臨床治療提供診療依據(jù)與治療靶點。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資源

首先繪制本研究設(shè)計流程圖，之后利用癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas, TCGA, https://portal.gdc.cancer.gov/)下載肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)的3級RNA測序信息和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)，其中包括374例HCC患者的腫瘤組織測序信息和50例正常肝組織測序信息。利用perl語言(perl 5.30.2)進行數(shù)據(jù)提取，之后將表達矩陣文件中的“Ensembl_Stable_ID”轉(zhuǎn)換為“Gene Symbol”，從人類自噬基因數(shù)據(jù)庫(Human Autophagy Database, HADb, http://www.autophagy.lu/)下載232個與自噬有關(guān)的基因信息。將表達矩陣中的基因與232個自噬相關(guān)基因取交集，重新整理為自噬相關(guān)基因的表達矩陣，并繪制Venn圖。由于本研究所用數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫，故不需要相關(guān)倫理學(xué)審核與批準。

1.2 自噬相關(guān)基因差異分析

使用R語言(R 3.6.3)中的limma包，篩選差異表達的基因，篩選標準為：錯誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate, FDR)BH法矯正后的閾值P.adj<0.01，對數(shù)差異表達倍數(shù)變化絕對值|log2FC|>1。使用pheatmap包繪制差異基因的火山圖，使用ggpubr包繪制差異基因箱線圖。

1.3 GO富集分析和KEGG通路分析

利用R語言對差異表達的自噬相關(guān)基因進行基因本體功能(Gene Ontology, GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway，KEGG pathway)分析。首先下載clusterProfiler、enrichplot和ggpggplot2三個數(shù)據(jù)包，閾值設(shè)置為P<0.01、Q<0.01，之后與基因組背景對比。通過GO富集分析，得到顯著富集的GO功能詞條(Term)，其中生物過程(Biological process，BP)、細胞成分(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)為主要的分析對象。通過KEGG通路分析，得到顯著性富集的pathway。

1.4 預(yù)后風(fēng)險評分模型構(gòu)建

利用perl語言將差異表達的自噬相關(guān)基因表達量與生存時間進行合并，剔除生存信息不完整的樣本。利用R語言中的survival包對差異基因進行單變量Cox回歸分析，設(shè)置閾值為P<0.001，明確基因表達水平與患者生存時間的關(guān)系，并繪制森林圖。之后挑選P<0.001的基因，利用survival包進行多因素Cox回歸分析，得到風(fēng)險基因，構(gòu)建可以預(yù)測生存時間的風(fēng)險評分模型，并輸出納入模型基因的風(fēng)險評分系數(shù)(Coef)。所構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險評分模型計算公式為：風(fēng)險值(risk score)=風(fēng)險基因表達量1×coef1+風(fēng)險基因表達量2×coef2+...+風(fēng)險基因表達量n×coefn。

1.5 預(yù)后風(fēng)險評分模型評價

根據(jù)風(fēng)險評分模型計算患者的風(fēng)險值，從低到高排序后依據(jù)中位數(shù)將患者分為低風(fēng)險組和高風(fēng)險組。利用survival包和survminer包進行Kaplan-Meier (K-M) 生存分析，明確風(fēng)險值和生存時間之間的關(guān)系，并繪制生存曲線。下載pheatmap包繪制高低風(fēng)險組的風(fēng)險曲線、生存狀態(tài)圖和風(fēng)險基因熱圖。將各組患者的生存時間、生存狀態(tài)、年齡、性別、WHO分級、分期、TNM分期及風(fēng)險評分整理為數(shù)值數(shù)據(jù)，其中：生存狀態(tài)(0，存活；1，死亡)、性別(0，女性；1，男性)，剔除臨床數(shù)據(jù)不完整的樣本，利用survival包進行單因素與多因素的獨立預(yù)后分析，并繪制森林圖。利用survival ROC包繪制各項獨立預(yù)后指標的ROC曲線，從而評估其預(yù)測的準確性。將各項臨床數(shù)據(jù)整理為二分類變量，整理標準為：生存時間(<中位生存期；>中位生存期；單位：天)、生存狀態(tài)(0，存活；1，死亡)、年齡(<=65歲；>65歲)、性別(男性；女性)、WHO分級(G1-2；G3-4)、分期(StageⅠ-Ⅱ；StageⅢ-Ⅳ)、T(T1-2；T3-4)、M(M0；M1)、N(N0、N1-3)。利用beeswarm包進行風(fēng)險基因表達量與風(fēng)險值同臨床數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性分析，以評估所篩選基因及構(gòu)建模型是否同臨床數(shù)據(jù)具有良好的相關(guān)關(guān)系。

1.6 風(fēng)險基因外部數(shù)據(jù)驗證

利用GEPIA2.0網(wǎng)頁工具中有關(guān)HCC的數(shù)據(jù)對模型中的風(fēng)險基因進行驗證，輸出表達量統(tǒng)計圖和生存曲線圖，利用人類蛋白圖譜(The Human Protein Atlas, HPA, https://www.proteinatlas.org/)中的臨床樣本來驗證風(fēng)險基因在正常與腫瘤組織中的的表達情況。

2 結(jié)果分析

2.1 自噬相關(guān)基因差異分析

利用TCGA數(shù)據(jù)庫下載到374例患者和50例正常肝組織樣本共計55 268個基因的表達數(shù)據(jù)，與自噬基因取交集繪制Venn圖(見圖1a)，差異分析后得到61個基因(表達上調(diào)57個，下調(diào)4個)，差異基因火山圖(見圖1b)，腫瘤和非腫瘤組織中差異基因的相對表達量整理為箱線圖(見圖1c)。

2.2 GO富集與KEGG通路富集分析

將61個自噬相關(guān)差異基因進行GO富集分析，共富集到225個GO terms，包括192個生物過程(BP)，15個細胞成分(CC)和18個分子功能(MF)。按照p值由小到大分別篩選各組前10個GO terms。在生物過程方面，差異基因主要富集在自噬、自噬機制過程和巨噬細胞吞噬的調(diào)控；在細胞成分方面，主要富集在泡膜、自噬體和溶酶體膜；在分子功能方面，富集在蛋白激酶調(diào)節(jié)劑活性、激酶調(diào)節(jié)劑活性和泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等。差異基因的KEGG通路富集分析共得到46條信號通路，按照p值由小到大排序篩選前10個通路，結(jié)果主要富集在自噬和細胞凋亡通路上。具體富集分析結(jié)果(見表1)。

表1 GO富集與KEGG通路分析Table 1 GO enrichment and KEGG pathway analyses

續(xù)(表1)分析類型ID描述基因比例矯正后P值Q值基因名字基因數(shù)量生物過程(BP)GO:0016241調(diào)節(jié)巨自噬(regulation of macroautophagy)13/614.09×10-122.77×10-12TSC2/RHEB/RUBCN/NPC1/MAPK3/CASP3/RPTOR/RB1CC1/GAPDH/MLST8/IRGM/TSC1/CAPNS113生物過程(BP)GO:0070997神經(jīng)元丟失(neuron death)13/612.90×10-81.97×10-8TP63/DDIT3/FOS/CLN3/PARP1/HSP90AB1/BAX/CAPN2/CASP3/HSPA5/CASP8/GAPDH/TSC113生物過程(BP)GO:2001233凋亡信號通路的調(diào)控(regulation of apoptotic signaling pathway)13/611.66×10-71.12×10-7TP63/DDIT3/PARP1/HDAC1/BAX/TP73/PEA15/ITGA6/PRKCD/RB1CC1/CASP8/BAK1/DAPK213生物過程(BP)GO:0000045自噬體組裝(autophagosome assembly)8/611.87×10-71.27×10-7ULK3/WDR45B/ATG16L2/VMP1/ATG9B/ATG4B/RB1CC1/IRGM8生物過程(BP)GO:1905037自噬體組織進入翻譯頁面(autophagosome organization)8/612.15×10-71.46×10-7ULK3/WDR45B/ATG16L2/VMP1/ATG9B/ATG4B/RB1CC1/IRGM8生物過程(BP)GO:0097193固有凋亡信號通路(intrinsic apoptotic signaling pathway)11/614.82×10-73.27×10-7TP63/DDIT3/PARP1/HDAC1/BAX/IKBKE/TP73/CASP3/PRKCD/BAK1/DAPK211細胞成分(CC)GO:0005776自噬體(autophagosome)9/612.50×10-91.93×10-9ATG16L2/CLN3/SQSTM1/RAB24/VMP1/ATG9B/DAPK2/IRGM/TMEM749細胞成分(CC)GO:0000407吞噬泡集合點(phagophore assemblysite)6/616.58×10-85.07×10-8ULK3/WDR45B/SQSTM1/VMP1/ATG9B/RB1CC16細胞成分(CC)GO:0005774液泡膜(vacuolar membrane)12/613.09×10-72.38×10-7DRAM1/ATG16L2/CLN3/RHEB/VMP1/HSP90AB1/NPC1/ATG9B/RPTOR/SPNS1/IRGM/TMEM7412細胞成分(CC)GO:0000421自噬體膜(autophagosome membrane)5/614.76×10-63.67×10-6ATG16L2/VMP1/ATG9B/IR-GM/TMEM745細胞成分(CC)GO:0098589膜區(qū)(membrane region)8/613.34×10-42.57×10-4CLN3/CAPN2/NPC1/MAPK3/CASP3/CD46/CASP8/RGS198細胞成分(CC)GO:0005765溶酶體膜(lysosomal membrane)8/613.90×10-43.00×10-4DRAM1/CLN3/RHEB/HSP90AB1/NPC1/RPTOR/SPNS1/TMEM748

續(xù)(表1)分析類型ID描述基因比例矯正后P值Q值基因名字基因數(shù)量細胞成分(CC)GO:0098852溶解液泡膜(lytic vacuole membrane)8/613.90×10-43.00×10-4DRAM1/CLN3/RHEB/HSP90AB1/NPC1/RPTOR/SPNS1/TMEM748細胞成分(CC)GO:0005770晚期胞內(nèi)體(late endosome)7/613.90×10-403.00×10-4DDIT3/CLN3/SQSTM1/HGS/RUBCN/NPC1/MAPK37細胞成分(CC)GO:0045121膜筏(membrane raft)7/611.20×1039.23×10-4CLN3/CAPN2/NPC1/MAPK3/CASP3/CASP8/RGS197細胞成分(CC)GO:0098857膜微結(jié)構(gòu)域(membranemicrodomain)7/611.20×1039.23×10-4CLN3/CAPN2/NPC1/MAPK3/CASP3/CASP8/RGS197分子功能(MF)GO:0019887蛋白激酶調(diào)節(jié)活性(protein kinase regulator activity)7/591.97×10-41.26×10-4HSP90AB1/CASP3/RPTOR/NRG1/CDKN2A/MLST8/IR-GM7分子功能(MF)GO:0004197半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性(cysteine-typeendopeptidase activity)6/591.97×10-41.26×10-4CAPN10/CAPN2/CASP3/ATG4B/CASP8/CAPNS16分子功能(MF)GO:0031072熱休克蛋白結(jié)合(heat shock protein binding)6/591.97×10-41.26×10-4TSC2/HSP90AB1/BAX/HSPA5/BAK1/TSC16分子功能(MF)GO:0051400BH域結(jié)合(BH domain binding)3/592.23×10-41.43×10-4BAX/BAK1/IRGM3分子功能(MF)GO:0019207激酶調(diào)節(jié)活動(kinase regulator activity)7/592.37×10-41.52×10-4HSP90AB1/CASP3/RPTOR/NRG1/CDKN2A/MLST8/IR-GM7分子功能(MF)GO:0051087伴侶蛋白結(jié)合(chaperone binding)5/597.11×10-44.56×10-4BAX/HSPA5/BIRC5/BAK1/TSC15分子功能(MF)GO:0004198鈣依賴性半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性(calcium-dependent cysteine-type endopeptidase activity)3/597.11×10-44.56×10-4CAPN10/CAPN2/CAPNS13分子功能(MF)GO:0008234半胱氨酸型肽酶的活動(cysteine-type peptidase activity)6/598.92×10-45.72×10-4CAPN10/CAPN2/CASP3/ATG4B/CASP8/CAPNS16分子功能(MF)GO:0044389泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)7/591.70×10-31.09×10-3SQSTM1/HGS/HSP90AB1/IKBKE/HSPA5/FOXO1/CASP87分子功能(MF)GO:0030295蛋白激酶激活物的活性(protein kinase activator activity)4/593.14×10-32.01×10-3RPTOR/NRG1/MLST8/IRGM4

續(xù)(表1)分析類型ID描述基因比例矯正后P值Q值基因名字基因數(shù)量KEGG通路分析hsa04140自噬-動物(Autophagy-animal)16/485.05×10-152.67×10-15TSC2/ATG16L2/SQSTM1/RHEB/VMP1/RUBCN/ATG9B/MAPK3/RPTOR/ATG10/ATG4B/PRKCD/RB1CC1/DAPK2/MLST8/TSC116KEGG通路分析hsa05165人類乳頭瘤病毒感染(Human papillomavirus infection)14/482.98×10-71.58×10-7TSC2/ITGA3/HDAC1/RHEB/BAX/IKBKE/MAPK3/CASP3/ITGA6/ITGB4/FOXO1/CASP8/BAK1/TSC114KEGG通路分析hsa04210細胞凋亡(Apoptosis)10/482.98×10-71.58×10-7DDIT3/FOS/PARP1/BAX/CAPN2/MAPK3/CASP3/CASP8/BIRC5/BAK110KEGG通路分析hsa01524鉑耐藥(Platinum drug resistance)7/488.89×10-64.71×10-6BAX/MAPK3/CASP3/CDKN2A/CASP8/BIRC5/BAK17KEGG通路分析hsa04211長壽蛋白調(diào)節(jié)通路(Longevity regulating pathway)7/482.67×10-51.42×10-5TSC2/RHEB/BAX/RPTOR/FOXO1/RB1CC1/TSC17KEGG通路分析hsa04136自噬-其他(Autophagy-other)5/482.67×10-51.42×10-5ATG9B/RPTOR/ATG10/ATG4B/MLST85KEGG通路分析hsa04215細胞凋亡-多物種(Apoptosis-multiple species)5/482.67×10-51.42×10-5BAX/CASP3/CASP8/BIRC5/BAK15KEGG通路分析hsa05162麻疹(Measles)8/482.79×10-51.47×10-5FOS/BAX/IKBKE/TP73/CASP3/CD46/CASP8/BAK18KEGG通路分析hsa04115p53信號通路(p53 signaling pathway)6/486.79×10-53.59×10-5TSC2/BAX/TP73/CASP3/CDKN2A/CASP86KEGG通路分析hsa04218細胞衰老(Cellular senescence)8/486.79×10-53.59×10-5TSC2/SQSTM1/RHEB/CAPN2/MAPK3/CDKN2A/FOXO1/TSC18

2.3 預(yù)后風(fēng)險評分模型構(gòu)建

剔除臨床信息不完整的樣本，共有370例HCC患者的表達數(shù)據(jù)被納入。61個自噬相關(guān)差異基因的單因素Cox回歸分析提示，共有12個基因和患者的生存預(yù)后明顯相關(guān)，整理為森林圖(見圖2)。多因素Cox回歸分析提示，有4個基因和患者的生存預(yù)后明顯相關(guān)，可作為風(fēng)險基因用來構(gòu)建預(yù)測模型(見表2)，分別是SQSTM1(HR 1.203，P=0.030)、HDAC1(HR 1.465，P=0.019)、RHEB(HR 1.526，P=0.026)和ATIC(HR 1.550，P=0.006)。所建立的預(yù)后風(fēng)險評分模型公式為：風(fēng)險值(riskscore)=SQSTM1表達量×0.185+HDAC1表達量×0.382+RHEB表達量×0.423+ATIC表達量×0.438。

表2 多因素Cox分析Table 2 Multivariate Cox analysis

圖2 單因素Cox分析森林圖Fig.2 Forest map for univariate Cox analysis

2.4 預(yù)后風(fēng)險評分模型評價

利用風(fēng)險評分模型計算公式計算370例患者的風(fēng)險值，共有185例患者屬于低風(fēng)險，185例患者為高風(fēng)險。Kaplan-Meier (K-M) 生存分析(見圖3a)顯示，高風(fēng)險患者的生存率明顯低于低風(fēng)險患者(P=2.967×10-4)。高風(fēng)險患者1年生存率為72.0%，低風(fēng)險為92.0%；3年生存率前者為50.0%，后者為71.0%。風(fēng)險曲線(見圖3b)表明從低到高排序后，患者的風(fēng)險值逐漸增大；生存狀態(tài)圖(見圖3c)表明高風(fēng)險組死亡個體數(shù)多于低風(fēng)險組；風(fēng)險基因熱圖顯示(見圖3d)高風(fēng)險組中SQSTM1、HDAC1、RHEB和ATIC的表達量均高于低風(fēng)險組，證明4個基因均為高風(fēng)險基因。單因素獨立預(yù)后分析(見圖3e)與多因素獨立預(yù)后分析(見圖3f)聯(lián)合說明，僅有風(fēng)險值可作為患者生存預(yù)后的危險因子，隨著風(fēng)險值增高，患者的生存率逐漸降低。獨立預(yù)后分析相關(guān)的ROC曲線(見圖3g)顯示，風(fēng)險值的AUC值為0.751，具有一定預(yù)測能力。風(fēng)險基因表達量與風(fēng)險值同臨床數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性分析表明，HDAC1(見圖4a)、ATIC(見圖4b)與風(fēng)險值(見圖4c)同生存時間呈負相關(guān)關(guān)系；SQSTM1(見圖4d)、HDAC1(見圖4e)、RHEB(見圖4f)與ATIC(見圖4g)的表達及風(fēng)險值(見圖4h)在死亡個體中均高于存活個體。因此，4個風(fēng)險基因及風(fēng)險值同患者的生存數(shù)據(jù)具有良好的相關(guān)關(guān)系，所構(gòu)建模型可用來評估患者的生存預(yù)后情況。

圖3 預(yù)后風(fēng)險評分模型評價Fig.3 Evaluation of prognostic risk score model

圖4 臨床相關(guān)性分析Fig.4 Clinical correlation analysis

2.5 風(fēng)險基因外部數(shù)據(jù)驗證

GEPIA2.0網(wǎng)頁工具中共有369例HCC患者數(shù)據(jù)和160例正常組織樣本，分別輸出SQSTM1(見圖5a)、HDAC1(見圖5b)、RHEB(見圖5c)和ATIC(圖見5d)的表達量統(tǒng)計圖(紅色代表腫瘤組織，黑色代表正常組織)，可見4個基因在腫瘤中表達量均高于正常組織樣本。輸出SQSTM1(見圖5e)、HDAC1(見圖5f)、RHEB(見圖5g)和ATIC(見圖5h)的生存曲線圖，發(fā)現(xiàn)高表達4個風(fēng)險基因組的生存率均低于低表達組。利用HPA數(shù)據(jù)庫中的臨床樣本病理學(xué)與組織學(xué)免疫組化染色圖發(fā)現(xiàn)，SQSTM1(見圖6a)、HDAC1(見圖6b)、RHEB(見圖6c)和ATIC(見圖6d)在腫瘤中的表達量均高于正常組織，這與GEPIA2.0中得到的統(tǒng)計圖結(jié)果一致。

圖5 GEPIA網(wǎng)頁工具Fig.5 GEPIA web tool

圖6 HPA數(shù)據(jù)庫Fig.6 HPA database

3 討 論

自噬在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜，不同的自噬相關(guān)基因發(fā)揮促癌或抑癌作用。通過單因素與多因素Cox回歸分析，將納入預(yù)后模型的4個基因賦予不同的風(fēng)險評分系數(shù)，以生存時間為判斷標準，明確其對腫瘤起促進作用或抑制作用，這也為后續(xù)治療靶點的選擇提供了依據(jù)。

已知 P62(即SQSTM1基因)是一個經(jīng)典的自噬標記基因，在溶酶體降解途徑中P62作為受體與泛素化蛋白結(jié)合并將其運送到自噬體參與選擇性自噬的過程，細胞內(nèi)自噬受損、P62蛋白累積使染色體突變從而促進細胞癌變、腫瘤形成。研究表明，P62和Caspase高表達的卵巢癌組織存活時間較低表達組織更長，P62和泛素化蛋白積累激活Caspase8，降低卵巢癌細胞對化療的敏感性，促進卵巢癌的進展[13]；在乳腺癌組織中， MYC的表達水平與P62增強乳腺癌細胞自我更新能力相關(guān)，高表達的P62通過抑制let-7a和let-7b的表達延緩MYC mRNA的降解，P62與MYC協(xié)同作用使乳腺癌惡化進展加速[14]；激活Wnt/β-catenin通路誘導(dǎo)下游因子過量表達會促進黑色素瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移，干擾P62表達后發(fā)現(xiàn)該通路及其下游因子的表達均受到抑制，表明P62可能通過調(diào)控該通路來促進癌細胞轉(zhuǎn)移[15]。

HDAC1(即組蛋白去乙?；?與HAT(組蛋白乙?；?共同調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；?，在真核細胞中組蛋白乙?；浇档蜁种撇糠忠职┗虻霓D(zhuǎn)錄從而促進癌癥發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1基因在多種腫瘤組織中高表達，且其高表達刺激癌細胞增殖；大腸癌細胞UVRAG突變可增強化療敏感性，HDAC1基因上調(diào)抑制UVRAG表達，促進大腸癌的發(fā)展[16]；抑制卵巢癌組織HDAC1基因表達將減弱卵巢癌細胞的增殖能力、逆轉(zhuǎn)癌組織順鉑耐藥性[17]；HDAC1在乳腺癌組織的表達水平顯著高于癌旁組織，其表達水平隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、臨床分期的增加而升高[18]。

細胞自噬受到RHEB基因(即腦Ras同源蛋白基因)的高度調(diào)控，該基因主要通過直接調(diào)節(jié)AMP活化蛋白激酶與控制mTOR信號通路進而調(diào)節(jié)其他ATGs兩條途徑來實現(xiàn)[19]；mTOR信號通路與細胞生長、增殖與分化有關(guān)，RHEB基因是激活mTOR信號通路的關(guān)鍵基因。肝癌組織中RHEB表達水平顯著高于正常組織，其表達水平隨肝癌組織的臨床分期而增加，敲除該基因發(fā)現(xiàn)HCC細胞生長速度和增殖能力明顯降低[20]，表明RHEB基因可能促進癌細胞生長增殖。

ATIC(氨基咪唑甲酰轉(zhuǎn)移酶)是一種雙功能蛋白酶，在生物合成過程中催化嘌呤合成的最后兩步。肝癌組織中異常高表達的ATIC通過抑制AMPK的激活，活化mTOR-s6K1-S6信號，促進癌細胞的生長、增殖和遷移[21]；研究表明，ATIC是一個有效的化療放射增敏靶點，通過基因敲除或化學(xué)抑制可以使癌細胞轉(zhuǎn)化到對輻射更敏感的細胞周期——G2/M期[22]，從而提高治療的有效性。

綜上所述，本研究所篩選到的4個風(fēng)險基因高表達與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，據(jù)此構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險評分模型有助于對HCC患者的預(yù)后情況進行評價，高風(fēng)險組患者應(yīng)接受更積極有效的治療。本研究的特色之處在于，根據(jù)自噬與腫瘤發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系這一前提出發(fā)，篩選到與患者生存預(yù)后密切相關(guān)的自噬基因，并成功構(gòu)建預(yù)后模型，為HCC患者的精準預(yù)后評估提供新方法；本研究篩選到的風(fēng)險基因，可作為HCC基礎(chǔ)研究與治療的可靠靶點；將風(fēng)險基因的表達與生存情況在GEPIA2.0網(wǎng)頁工具與HPA數(shù)據(jù)庫中進行多維度的驗證，具有一定新穎性。本研究的不足之處在于，沒有在其他數(shù)據(jù)集中對所構(gòu)建模型進行有效驗證，從而提高模型的可靠性；沒有針對風(fēng)險基因在動物或細胞水平進行功能驗證；所構(gòu)建的預(yù)后模型仍需大規(guī)模多中心的臨床試驗進行檢驗；這些將在后續(xù)的研究中進一步探討。

4 結(jié) 論

1)本研究聯(lián)合TCGA數(shù)據(jù)庫與人類自噬數(shù)據(jù)庫得到61個腫瘤組織中相較正常組織差異表達的自噬相關(guān)基因(DE-ATGs)，對其進行GO富集和KEEG通路分析發(fā)現(xiàn)，DE-ATGs主要富集在自噬、利用自噬機制過程、細胞凋亡等過程中。

2)單因素和多因素Cox回歸分析篩選到4個與患者生存預(yù)后顯著相關(guān)的基因，分別是SQSTM1、HDAC1、RHEB和ATIC，所構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險評分模型為：風(fēng)險值(Risk score)=SQSTM1表達量×0.185+HDAC1表達量×0.382+RHEB表達量×0.423+ATIC表達量×0.438。

3)根據(jù)模型將HCC患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，生存分析與臨床相關(guān)性分析顯示，4個風(fēng)險基因與HCC患者的生存預(yù)后密切相關(guān)。