通過生物信息學(xué)分析鑒定CYB561與浸潤(rùn)性乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)

丁慶林，魏艷紅，孫 鴿，胡康洪

(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院中德生物醫(yī)學(xué)中心，湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部及國(guó)家外專局“細(xì)胞調(diào)控與分子藥物學(xué)科111創(chuàng)新引智基地”， 武漢 430068)

浸潤(rùn)性乳腺癌(Breast invasive carcinoma, BRCA)是全世界女性癌癥死亡的第二大原因[1]。BRCA被認(rèn)為是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，基于組織病理學(xué)特征和治療反應(yīng)，其表現(xiàn)出顯著的多樣性，傳統(tǒng)療法(如乳房X線照相術(shù))無法更好應(yīng)對(duì)乳腺癌的挑戰(zhàn)[2]。與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的基因標(biāo)記在預(yù)測(cè)乳腺癌的預(yù)后方面具有局限性[3]，需要不斷完善乳腺癌的治療策略，以達(dá)到更好的患者預(yù)后[1,4]。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在乳腺癌發(fā)展進(jìn)程中與預(yù)后相關(guān)聯(lián)，關(guān)注免疫細(xì)胞浸潤(rùn)可以幫助患者尋找新的治療方法，借助公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，有助于更好地尋找乳腺癌預(yù)后或預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物[3,5]。研究表明， BRCA1相關(guān)環(huán)指結(jié)構(gòu)域-1 (BRCA1-associated RING domain, BARD1)在乳腺癌中上調(diào)，其高表達(dá)與乳腺癌的無病生存(Disease-free survival, DFS)和遠(yuǎn)處無轉(zhuǎn)移生存(Distant metastasis-free survival, DMFS)差有關(guān)[6]；血清脂質(zhì)運(yùn)載蛋白1(Lipocalin-1, LCN1)在BRCA中高表達(dá)，低表達(dá)LCN1與BRCA中無復(fù)發(fā)生存(Relapse-free survival, RFS)的不良預(yù)后相關(guān)[2]；Janus激酶1 (Janus kinase-1, JAK1) 在乳腺癌中低表達(dá)，且與較差的總體生存(Overall survival, OS)和無復(fù)發(fā)生存(RFS)有關(guān)[7]；脂滴包被蛋白(Perilipin-1, PLIN1)在乳腺癌中明顯下調(diào)，與較差的總體生存(OS)相關(guān)[8]，這些數(shù)據(jù)揭示了乳腺癌中具有預(yù)后意義的潛在基因治療靶標(biāo)。

細(xì)胞色素b561(Cytochromes b561, CYB561)又稱Uniprot P49447，因在561 nm處具有吸光性而得名。CYB561氨基酸序列高度保守，是具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的單體蛋白質(zhì)[9]。該蛋白質(zhì)附著在神經(jīng)內(nèi)分泌組織中的兒茶酚胺和神經(jīng)肽分泌小泡的膜上，對(duì)兒茶酚胺的生物合成至關(guān)重要[10]。腫瘤抑制因子CYB561蛋白是抗壞血酸(ASC)可還原的跨膜二血紅素蛋白，維持胞質(zhì)和囊內(nèi)抗壞血酸之間的氧化還原狀態(tài)[11]。它在人體組織中廣泛表達(dá)。在大腦中，它在皮質(zhì)和海馬中強(qiáng)烈表達(dá)，而在其他部位則表達(dá)程度較低，在各種神經(jīng)內(nèi)分泌組織中都證實(shí)了它的存在[12]。CYB561與細(xì)胞代謝和線粒體激活相關(guān)[13]，研究表明其可能是卵巢癌的單基因預(yù)后生物標(biāo)志物[14]。本研究發(fā)現(xiàn)CYB561在BRCA中失調(diào)，提示其可能在BRCA的發(fā)生發(fā)展中具有潛在作用。

1 材料和方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析

在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.oncomine.org/resource/login.html)中確定了CYB561基因在各種類型癌癥中的表達(dá)水平[15]。 根據(jù)以下值確定閾值：P值為0.001，倍數(shù)變化為2，所有基因的基因排名。

1.2 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析

在TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)中使用Diff Exp模塊來探索腫瘤與相鄰正常組織之間靶基因的差異表達(dá)；使用Gene模塊分析了CYB561表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性，包括B細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[16-18]。

1.3 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)

在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)中根據(jù)性別，年齡，種族，疾病階段和腫瘤等級(jí)等進(jìn)行多亞組分類，分析患者CYB561表達(dá)[19]。

1.4 cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)

使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.cbioportal.org/)分析CYB561基因組改變類型，不同表型的乳腺癌改變頻率以及氨基酸中的蛋白質(zhì)變化[20-21]。

1.5 LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫(kù)

利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.linkedomics.org/login.php)，研究TCGA BRCA隊(duì)列(n = 1 093)中與CYB561相關(guān)的差異表達(dá)基因[22]。

1.6 WebGestalt 數(shù)據(jù)庫(kù)

對(duì)獲得的差異基因，使用WebGestalt 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.webgestalt.org/)進(jìn)行基因本體論(gene ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析，研究CYB561在BRCA中的生物學(xué)作用[23]。

1.7 PrognoScan數(shù)據(jù)庫(kù)

通過PrognoScan數(shù)據(jù)庫(kù)(http://dna00.bio.kyutech.ac.jp/PrognoScan/index.html)分析了CYB561表達(dá)與BRCA患者預(yù)后之間的相關(guān)性，例如總生存期(OS)和無病生存期(DFS)和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期(DMFS)[24]。 將閾值調(diào)整為CoxP值<0.05。

1.8 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)

通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析了TCGA和GTEx項(xiàng)目的BRCA中CYB561表達(dá)和患者總生存期(OS)之間的相關(guān)性[25]。

2 結(jié)果分析

2.1 不同類型人類癌癥中CYB561的mRNA表達(dá)水平

使用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析多種癌癥類型的不同腫瘤和正常組織中的CYB561 mRNA水平表明，與正常組織相比，CYB561在乳腺癌(Breast Cancer)中表達(dá)更高(見圖1a)，進(jìn)一步分析Ma Breast 4，Curtis Breast，TCGA Breast和Finak Breast 4種不同的BRCA數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)CYB561 在BRCA組織中mRNA表達(dá)均顯著高于在正常組織(p< 0.01，F(xiàn)old Change > 2)(見圖1c～f)。使用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CYB561的腫瘤與相鄰正常組織之間的差異表達(dá)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)CYB561在多種癌癥中失調(diào)(見圖1b)，提示其在BRCA和多種癌癥發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中可能具有潛在作用。

圖1 CYB561在不同類型的人類癌癥中的表達(dá)水平(Oncomine和 TIMER)Fig. 1 CYB561 expression levels in different types of human cancer (Oncomine and TIMER)

為探究CYB561表達(dá)量與臨床特征之間的關(guān)系，對(duì)TCGA中1097例BRCA樣品進(jìn)行多亞組分析，結(jié)果顯示BRCA患者中CYB561表達(dá)明顯高于健康人(見圖2a～h)。在性別(見圖2b)、種族(見圖2d)、癌癥等級(jí)(見圖2e)、更年期狀態(tài)(見圖2f)和乳腺癌分型(見圖2g)亞組顯示出組間差異，在年齡(見圖2c)和TP53突變狀態(tài)(見圖2h)亞組間無顯著差異。從第1階段到第4階段，CYB561表達(dá)在乳腺癌中呈逐漸增加，并且在第4階段中發(fā)現(xiàn)最高的CYB561表達(dá)，表明CYB561表達(dá)與癌癥各個(gè)階段密切相關(guān)。CYB561在不同分型的BRCA中顯示出差異，可用于輔助區(qū)分不同分型的乳腺癌。以上結(jié)果表明，高CYB561表達(dá)與浸潤(rùn)性乳腺癌多種臨床特征相關(guān)，可將CYB561的表達(dá)作為BRCA中潛在的診斷指標(biāo)。

圖2 BRCA患者不同亞組中CYB561的相對(duì)表達(dá)水平(UALCAN)Fig. 2 Relative expression levels of CYB561 in different subgroups of patients with BRCA (UALCAN)注：根據(jù)性別，年齡，性別，種族，腫瘤等級(jí)、更年期狀態(tài)、乳腺癌分型和TP53突變狀態(tài)進(jìn)行分組(P<0.05)

2.2 通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)了CYB561的基因組突變

基因組突變與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[2]。浸潤(rùn)性乳腺癌中許多位點(diǎn)的乳腺浸潤(rùn)前病變均在染色體出現(xiàn)異常變化[26]。為此，使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析了BRCA中CYB561的基因組改變情況。數(shù)據(jù)顯示，CYB561基因組遺傳變異約為7%(見圖3a)，包括拷貝數(shù)擴(kuò)增、融合和意義不明的錯(cuò)義突變。而且，CYB561的遺傳改變頻率在各種浸潤(rùn)性乳腺癌中表現(xiàn)出差異(見圖3b),且存在拷貝數(shù)變異和氨基酸點(diǎn)位突變(見圖3c～d)。以上結(jié)果提示，BRCA中發(fā)現(xiàn)CYB561的基因改變，可能在浸潤(rùn)性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

圖3 BRCA中CYB561的基因組突變(cBioPortal)Fig. 3 Genomic mutations of CYB561 in BRCA (cBioPortal)

2.3 BRCA中與CYB561相關(guān)的差異表達(dá)基因的富集分析

CYB561在BRCA中潛在的功能，可能是由于CYB561基因組改變以及和多個(gè)基因共同作用的結(jié)果。為此，使用LinkedOmics分析出與CYB561正負(fù)相關(guān)50個(gè)關(guān)鍵基因(見圖 4a～b)。并對(duì)其采用WebGestalt 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO的生物學(xué)功能(Biological Process, BP)和KEGG富集分析(見圖 5a～b)。結(jié)果表明，其參與的生物學(xué)過程有線粒體基因表達(dá)、高爾基小泡運(yùn)輸、線粒體運(yùn)輸、前體代謝產(chǎn)物和能量的變化、細(xì)胞趨化性、白細(xì)胞分化、積極調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、白細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)；參與的信號(hào)通路有：蛋白酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、溶酶體、代謝途徑、ECM受體相互作用、Wnt信號(hào)通路、細(xì)胞粘附分子、破骨細(xì)胞分化、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用。富集分析結(jié)果，有助于了解CYB561及其相互作用基因在BRCA中的作用機(jī)理和過程。

圖4 BRCA中與CYB561相關(guān)的差異表達(dá)基因(LinkedOmics)Fig. 4 Differentially expressed genes associated with CYB561 in BRCA (LinkedOmics)注：(a,b)熱圖顯示BRCA中與CYB561正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因(前50名)。 紅色表示正相關(guān)的基因，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)的基因。

圖5 CYB561在BRCA中顯著豐富的GO注釋和KEGG途徑(WebGestalt)Fig. 5 Significantly enriched GO annotations and KEGG pathways of CYB561 in BRCA (WebGestalt)注：使用GSEA分析了BRCA中CYB561共表達(dá)基因的GO注釋和KEGG途徑的顯著富集。

2.4 CYB561在癌癥中的預(yù)后潛力

了解CYB561在BRCA中參與的生物學(xué)過程后，我們使用PrognoScan和GEPIA評(píng)估了CYB561表達(dá)與BRCA癌癥患者的預(yù)后關(guān)系。不同的數(shù)據(jù)集結(jié)果均顯示，相較于低表達(dá)組，CYB561高表達(dá)組患者總體生存(Overall Survival, OS)、無病生存(Disease-Free Survival, DFS)、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存(Distant Metastasis-Free Survival, DMFS)均較差(見圖6a～f)，提示浸潤(rùn)性乳腺癌中高CYB561表達(dá)可能是一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，并導(dǎo)致BRCA患者的不良預(yù)后。

圖6 Kaplan-Meier生存曲線比較乳腺癌人群中CYB561的高表達(dá)和低表達(dá)(PrognoScan 和 GEPIA)Fig. 6 Kaplan-Meier survival curves for comparing the higher and lower expressions of CYB561 in breast cancer cohorts (PrognoScan and GEPIA)

2.5 免疫浸潤(rùn)與BRCA中的CYB561相關(guān)

浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞與部分癌癥預(yù)后相關(guān)[27-28]。為此，我們探究了CYB561表達(dá)高導(dǎo)致BRCA不良預(yù)后與浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)性。結(jié)果表明，CYB561表達(dá)與BRCA的腫瘤純度正顯著相關(guān)，并與BRCA的B 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平顯著正相關(guān)(見圖7a,c,e)，與樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平顯著負(fù)相關(guān)(見圖7b,d)，表明CYB561 mRNA水平在BRCA免疫浸潤(rùn)中具有潛在作用。累積存活表明，BRCA中CYB561的免疫浸潤(rùn)B細(xì)胞具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，表明B細(xì)胞顯著影響預(yù)后 (見圖7f)，值得進(jìn)一步探究。研究CYB561與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系，有助于為未來BRCA免疫治療提供新視野。

圖7 BRCA的B細(xì)胞，CD4 + T細(xì)胞，CD8 + T細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中與CYB561相關(guān)的免疫浸潤(rùn)(TIMER)Fig. 7 Immune infiltrates in correlation with CYB561 in B cells, CD4+ T cells, CD8+ T cells, neutrophil, and dendritic cells of BRCA (TIMER)注：(f)曲線正相關(guān)：Rho>0, p<0.05; 負(fù)相關(guān)：Rho>0, p<0.05.

3 討 論

人類CYB561 mRNA的翻譯控制通過腎上腺素途徑的調(diào)節(jié)影響心率和血壓[9,30]。其他CYB561蛋白可還原鐵化合物[31]。CYB561成員與生理過程有關(guān)，包括鐵攝取神經(jīng)內(nèi)分泌組織中的ASC再生和腫瘤生長(zhǎng)[32]。CYB561 3’-UTR中一個(gè)非常常見的遺傳變異(MAF～45%-49%)會(huì)改變對(duì)特定微RNA(hsa-miR-1294)的反應(yīng)，最終導(dǎo)致基礎(chǔ)和應(yīng)激的遺傳變化[9]。正常人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞(NHOK)中的衰老發(fā)生與CYB561基因表達(dá)的改變有關(guān)[33]。編碼CYB561基因中的致病性純合突變，導(dǎo)致去甲腎上腺素的合成停止，引起的新型常染色體隱性體位性低血壓綜合征[34]。卵巢癌中CYB561 mRNA表達(dá)水平較低且與預(yù)后不良相關(guān),可能是已知拮抗劑或抑制劑的治療靶標(biāo)[14]。目前針對(duì)CYB561的研究較少，未見CYB561關(guān)于BRCA報(bào)道，其功能和作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)CYB561多種類型癌中失調(diào)，且在BRCA中高表達(dá)，在4種乳腺癌數(shù)據(jù)集中證實(shí)了我們的結(jié)論。基于臨床病例特征進(jìn)行亞組分析表明，CYB561對(duì)所有亞型和不同種族的乳腺癌診斷有用，可能是潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，有待臨床驗(yàn)證。基因組不穩(wěn)定性更高的癌癥具有更高的基因組多樣性和更多的突變[35-36]，部分位點(diǎn)存在基因組改變是BRCA的特點(diǎn)之一， CYB561基因組發(fā)生的遺傳改變，提示其可能在BRCA中具有潛在作用。 對(duì)CYB561相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，有助于了解CYB561在BRCA中參與的生物學(xué)過程和信號(hào)通路，為研究CYB561在BRCA中的作用提供方向。研究預(yù)后因素，有助于臨床治療的決策。研究表明，高表達(dá)CYB561與較差的OS、DFS和DMFS有關(guān)，可能是BRCA預(yù)后不良的預(yù)測(cè)指標(biāo)，表明CYB561表達(dá)水平可能是BRCA生存需要考慮的重要因素。不同免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度與BRCA預(yù)后存在相關(guān)性，基因組改變?nèi)菀讓?dǎo)致更多新抗原，進(jìn)而產(chǎn)生更大的免疫浸潤(rùn)[35-36]，分析發(fā)現(xiàn)CYB561表達(dá)與部分浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)水平相關(guān)，且B細(xì)胞對(duì)BRCA預(yù)后有影響，值得進(jìn)一步探究。我們的研究為理解CYB561在腫瘤免疫學(xué)中的潛在作用及其作為癌癥生物標(biāo)志物的應(yīng)用提供了新視角。

4 結(jié) 論

本研究中的數(shù)據(jù)首次闡述了CYB561在BRCA中高表達(dá)，并與部分臨床病理特征相關(guān)，高表達(dá)CYB561與不良預(yù)后相關(guān)，可作為BRCA潛在的預(yù)后指標(biāo)，為了解CYB561 mRNA在腫瘤免疫學(xué)中的潛在作用及其預(yù)后價(jià)值提供了見識(shí)。盡管本研究提供了CYB561在BRCA中的一些有意義的數(shù)據(jù)，但也必須看到我們的研究存在一定的局限性:一方面是我們的結(jié)果未在臨床樣本中得到驗(yàn)證，無法提供準(zhǔn)確的臨床數(shù)據(jù)支撐;另一方面是BRCA的組織學(xué)類型和多個(gè)解剖部位的檢驗(yàn)結(jié)果可能存在較大差異。后續(xù)我們將進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和人體組織標(biāo)本測(cè)試以驗(yàn)證本研究結(jié)果，并評(píng)估CYB561抑制劑干擾免疫細(xì)胞的潛力。