基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯治療雷諾綜合征的機(jī)制

周志鋒，郭會(huì)卿，曹玉舉，趙晶晶，袁都戶

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450000；2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450000；3.鄭州中醫(yī)骨傷病醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

0 引言

雷諾綜合征(Raynaud’s syndrome,RS)是一種陣發(fā)性動(dòng)脈痙攣性疾病[1]。發(fā)病率大約是5%，女性多于男性[2]，分為特發(fā)性和繼發(fā)性兩種[3]。西醫(yī)治療分為藥物治療和手術(shù)治療，相關(guān)藥物如鈣通道阻滯劑(CCB)、磷酸二酯酶-5 抑制劑(PDE-5)、內(nèi)皮素受體拮抗劑等，藥物治療無效者可行交感神經(jīng)阻斷術(shù)[4],然其遠(yuǎn)期療效欠佳且復(fù)發(fā)率較高。

當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯出自《傷寒論》，具有溫通血脈，祛除里寒的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯能促進(jìn)外周血液循環(huán),增加血流并改善末梢循環(huán)障礙[5]。廣泛用于治療宮寒不孕、月經(jīng)后期[6]、雷諾氏病 (肢端動(dòng)脈痙攣病)[7]、厥陰寒化證[8]等。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法對(duì)當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯進(jìn)行研究，從而探討其治療雷諾綜合征的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 中藥活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選

應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)對(duì)當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯（當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、通草、大棗、吳茱萸、生姜）有效活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，篩選條件為口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Druglike，DL）≥0.18。進(jìn)一步應(yīng)用人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(UniprotDatabase,https://www.uniprot.org/) 對(duì)各靶點(diǎn)人類基因簡(jiǎn)稱進(jìn)行查詢。

1.2 本病相關(guān)靶點(diǎn)

以“Raynaud’s syndrome”為檢索詞，應(yīng)用人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards,https://genealacart.genecards.org/)、在線《人類孟德爾遺傳》數(shù)據(jù)庫（OMIM,https://www.omim.org/）、藥物基因組學(xué)知識(shí)庫（PharmGkb，https://www.pharmgkb.org/)、藥物和疾病數(shù)據(jù)庫（DrugBank,https://go.drugbank.com/)進(jìn)行檢索，獲得雷諾綜合征相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 藥物與疾病交集靶點(diǎn)篩選及“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用R語言（https://www.r-project.org/）將化合物潛在靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，獲取當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯治療RS 的交集靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape3.6.1（https://cytoscape.org/）繪制“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)（node）分別代表藥物、成分或靶點(diǎn)，邊（edge）代表節(jié)點(diǎn)間的相互關(guān)系。在本研究中，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)與自由度（degree）值呈正相關(guān)，節(jié)點(diǎn)自由度值的大小決定了其在網(wǎng)絡(luò)中的地位，從而說明其生物學(xué)重要性。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心靶標(biāo)篩選

首先將交集基因上傳至STRING 平臺(tái)（https://string/db.org/）構(gòu)建共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)，其中模式為“multiple proteins”，蛋白種屬為“Home sapiens”，將0.4 作為最小互作分?jǐn)?shù)值,其他參數(shù)保持默認(rèn),從而獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型，然后將其導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1，通過插件CytoNCA對(duì)每個(gè)節(jié)點(diǎn)的打分進(jìn)行計(jì)算，篩選出打分較高的節(jié)點(diǎn)并再次構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，最終得出PPI 網(wǎng)絡(luò)中核心基因。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入R 語言，并進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析。GO 富集分析由生物過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和細(xì)胞組分（Cellular component，CC）三個(gè)部分組成。將P<0.05 作為其篩選標(biāo)準(zhǔn)，從而富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.6 分子對(duì)接

為驗(yàn)證篩選出的當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯治療RS的可能關(guān)鍵靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，將調(diào)控網(wǎng)絡(luò)度值靠前的活性成分與PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涞玫降暮诵牡陌悬c(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。通過PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）下載核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)；通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載化合物結(jié)構(gòu)。應(yīng)用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，通過Pymol 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行輸出優(yōu)化。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯有效成分及靶點(diǎn)

在TCMSP 中,符合篩選條件的有效成分共256 個(gè)，其中當(dāng)歸2 個(gè)，桂枝7 個(gè)，芍藥13 個(gè)，生姜5 個(gè)，通草32 個(gè)，吳茱萸176 個(gè)，細(xì)辛8 個(gè)，大棗29 個(gè)。在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中找到對(duì)應(yīng)基因名的靶點(diǎn)有211個(gè)（圖1）。

2.2 當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯治療RS 作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過檢索genecards、omim、PharmGkb、Drug Bank 數(shù)據(jù)庫刪除重復(fù)值后得到1163 個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。利用R 語言得到當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯治療RS的潛在基因86 個(gè)（圖1）。

圖1 當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯與RS 共同靶點(diǎn)

2.3 “化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析

將化合物、靶點(diǎn)輸入Cytoscape 軟件，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖2）。網(wǎng)絡(luò)圖中共有120 個(gè)節(jié)點(diǎn)，“Degree”值排名前4 的化合物分別是槲皮素、山柰酚、谷固千金藤啶堿、β-谷固醇（表1）。

表1 度值前10 的活性成分

圖2 “有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心靶點(diǎn)篩選

將篩選得到的當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯治療RS 的86 個(gè)基因上傳至String 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白與蛋白的相互作用分析（圖3），并保存CSV 文件。將CSV 文件導(dǎo)入Cytoscape3.6.1 軟件并利用CytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯罱K獲取核心基因AKT1、JUN、CXCL8、TP53、VEGFA、CASP3、PTGS2、IL1B、MMP9（圖4）。

圖3 交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊诵幕?/p>

2.5 生物過程及通路富集分析

通過R 語言對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，分析發(fā)現(xiàn)，GO 富集分析主要涉及生物過程（BP）1777 個(gè)，細(xì)胞組分（CC）80 個(gè)，分子功能（MF）128 個(gè)（圖5）；KEGG 通路富集分析共涉及136 條通絡(luò)，主要包括AGE-RAGE 信號(hào)通絡(luò)、TNF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路等（圖6）。提示當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯可能通過這些通路發(fā)揮對(duì)RS 的治療作用。

圖5 交集靶點(diǎn) GO 富集分析

圖6 交集靶點(diǎn) KEGG 通路富集分析

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

選取核心基因排名靠前的AKT1、JUN、CXCL8、VEGFA、CASP3、PTGS2、IL1B 靶蛋白與度值排名前4的化合物（槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、千金藤啶堿）進(jìn)行分子對(duì)接（表2），選取最低結(jié)合能組合，使用Pymol 軟件選取最低結(jié)合能進(jìn)行繪圖（圖7）。最低結(jié)合能越低，靶蛋白與活性成分之間結(jié)合活性度越高，說明兩者之間結(jié)合能力越好[9]。結(jié)果表明靶蛋白與主要有效成分具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。

表2 主要化合物與主要靶點(diǎn)對(duì)接情況

圖7 化學(xué)成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接圖

3 討論

雷諾病根據(jù)其臨床表現(xiàn),屬于中醫(yī)“厥證”范疇?！端貑枴へ收摗分赋觯骸皻庖蛴谥?陽氣衰,不能滲營(yíng)其經(jīng)絡(luò),陽氣日損,陰氣獨(dú)在,故手足為之寒也?！币虼?本病系陰寒內(nèi)盛,腎陽虛衰,復(fù)被寒邪所中,內(nèi)外合邪,血?dú)膺\(yùn)行不暢所致。當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯中的當(dāng)歸、白勺養(yǎng)血活血通絡(luò)，桂枝、細(xì)辛、吳茱萸、生姜溫腎助陽逐寒，通草疏通血脈，全方共奏溫經(jīng)散寒、溫陽通脈之效，臨床用于治療雷諾綜合征療效顯著。

從調(diào)控網(wǎng)絡(luò)得到槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、千金藤啶堿等關(guān)鍵化合物。有相關(guān)證據(jù)表明，血管調(diào)控失衡與RS 密切相關(guān)[10-11]。槲皮素是一種常見的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗血栓形成等作用?？赏ㄟ^降低氧化應(yīng)激信號(hào)通路、抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路改善組織缺血再灌注損傷[12]。山奈酚能抑制TNF-a 和IL-6 等細(xì)胞因子的水平以及NF-kB 激活，保護(hù)血管免受氧化應(yīng)激和炎癥引起的損傷[13]。β-谷甾醇是一種安全的天然藥物,具有抗炎、抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗高血脂、鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理活性[14]。實(shí)驗(yàn)研究表明β-谷甾醇對(duì)血管細(xì)胞粘附分子1（VCAM-1）有明顯的抑制作用，進(jìn)而抑制血小板及血紅蛋白聚集形成血栓[15]。腎上腺素能受體(AR)是一種神經(jīng)纖維,其對(duì)溫度極其敏感，可通過與其受體相結(jié)合從而發(fā)揮縮血管的作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，左旋千金藤啶堿(l-SPD)能阻斷β 腎上腺素受體[17]，進(jìn)而發(fā)揮治療雷諾綜合征的作用。

由蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)可知AKT1、JUN、CXCL8、VEGFA、CASP3、PTGS2、IL1B 等9 個(gè)靶點(diǎn)是雷諾綜合征互作網(wǎng)絡(luò)中主要靶蛋白。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)可以導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)異常，并在RP 的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[18]。AKT1（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）可以被多種上游細(xì)胞因子（如VEGF 等）激活，發(fā)揮保護(hù)缺血性損傷后的神經(jīng)元的作用[19]。

在KEGG 分析的過程中，RS 與AGEs-RAGE 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、HIF-1、NF-κB 信號(hào)通路密切相關(guān)。當(dāng)NF-κB 被AGEs-RAGE 信號(hào)通路激活后,進(jìn)入細(xì)胞核,在核內(nèi)同多種基因啟動(dòng)子特異性序列結(jié)合,引起大量黏附分子、生長(zhǎng)因子、促炎細(xì)胞因子(如IL-6、IL-8、IL-α)等的表達(dá)和釋放,最終引起慢性細(xì)胞活化和組織損傷[20]，導(dǎo)致血漿粘度上升。RS 是以限制血液流向四肢造成缺氧為特征血管痙攣性疾病。由于缺氧反應(yīng)途徑的復(fù)雜性，抗缺血治療仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1 是一種異質(zhì)二聚體轉(zhuǎn)錄因子，在維持人體氧氣穩(wěn)態(tài)方面有重要作用[21]。HIF-1α的重要下游基因是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),后者是一種低氧敏感基因,能夠被HIF-1α 誘導(dǎo)上調(diào),促進(jìn)血管新生，從而發(fā)揮抗缺氧作用[22]。90%以上的系統(tǒng)性硬化征(systemic sclerosis,SSc) 病人以繼發(fā)性RP 為首發(fā)癥狀，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前臨床以口服藥物治療為主,但效果不佳[23]。松弛素是一種眾所周知的抗纖維化肽激素，能夠激活多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路，一方面通過抑制炎癥和成纖維細(xì)胞活化，減少纖維化；另一方面，松弛素還能促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)和活性，促進(jìn)異常膠原的降解，降低血漿纖維蛋白程度[24]。

分子對(duì)接表明配體和受體的結(jié)合能均≤-6 kcal·mol-1，結(jié)合位點(diǎn)均有穩(wěn)定的氫鍵和疏水鍵，其構(gòu)象穩(wěn)定，其中β-谷固醇與AKT1 的結(jié)合（-10.6 kcal·mol-1）最為穩(wěn)定。分子對(duì)接的結(jié)果說明，當(dāng)歸四逆吳茱萸生姜湯活性成分可以與受體蛋白穩(wěn)定結(jié)合，從而起到治療雷諾綜合征的作用。

綜上所述，在治療雷諾綜合征方面，當(dāng)歸四逆吳茱萸湯具有多靶點(diǎn)、多途徑、多通路的特點(diǎn)。本文不僅為其臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為探索新的治療方法提供思路。