基于谷胱甘肽配體的ZnSe量子點對pH響應的時間分辨熒光光譜特性

周子皓， 楊 帆， 李 棟， 王建平， 徐建華*

1. 華東師范大學精密光譜科學與技術國家重點實驗室， 上海 200241 2. 中國科學院化學研究所分子反應動力學實驗室， 北京 100190 3. 北京分子科學國家研究中心， 北京 100190

引 言

大量研究表明， 生物體系所處環境的pH值， 對生物體許多生命活動具有十分重要的影響。 例如， 細胞內酶活性的調節[1]、 細胞的生長與分化， 以及細胞凋亡等[2]， 生物體中某些疾病的發生也與生物系統內pH值的異常變化有關[3]。 所以， 監測生物體內pH值的變化， 對了解生物體所處狀態具有重要意義。 目前， 較為常用的幾種測定生物體系pH值的方法有核磁共振影像法、 微電極法、 熒光光譜法等等[4]。 其中， 由于熒光光譜技術具有操作簡單、 重復性好等優點， 常被用做實驗中pH值的檢測[4]。

半導體量子點是眾多納米材料的一種， 其三維空間尺寸均在納米量級， 因此具有許多獨特的物理化學性質。 比如， 量子點具有較大的比表面積， 其內部包含原子較少， 幾乎所有原子都處于表面狀態[5]， 量子點的表面剩余價鍵增多[6]， 出現較多的活性中心， 導致其具有較強的表面與界面效應， 使得量子點表面對周邊環境具有較大的靈敏性[7]。

研究發現， 量子點由于表面結構對pH值具有較強的靈敏性[8]， 因而人們常利用其對pH值的響應來研究生物體系pH值的變化[9]。 目前， 量子點對pH值的響應在生物領域已有較多實例。 Deng等[10]通過制備pH敏感的CdTe量子點作為pH值熒光探針來實現對病毒的檢測； Li等[11]通過合成對巰基苯胺包覆的CdSe/ZnS量子點， 被用來作為檢測水相中pH值的熒光探針； 當前有關量子點pH響應方面的研究主要集中在含Cd類量子點， 且都是研究其穩態熒光光譜對pH值的響應。 然而， Cd類量子點對生物體系具有一定的毒性， 且穩態熒光光譜法由于受濃度等因素的影響具有一定的不穩定性， 因此應用于生物體系中作為pH探針具有明顯的缺點。

研究證實[12]， ZnSe量子點具有生物毒性小， 生物相容性好等特點， 非常適合應用于生物體系中。 本文通過水相合成法制備了以谷胱甘肽為配體的ZnSe量子點并研究了其熒光壽命對不同pH值的響應規律。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

研究所使用的主要化學試劑， 均來源于商業購買， 且使用時均未進一步純化。 硒粉(Selenium, Se)， 分析純， 98%， 上海阿拉丁試劑公司； 二水合醋酸鋅(Zinc acetate dehydrate, ZnAc2·2H2O)， 分析純， 98%， 國藥試劑有限公司； 谷胱甘肽(L-glutathione， GSH)， 分析純， 98%， 阿拉丁試劑公司； 硼氫化鈉(Sodium borohydride， NaBH4)， 分析純， 98%， 阿拉丁試劑公司。

穩態吸收光譜數據的采集是使用紫外-可見分光光度計(TU1901， 北京普析通用儀器有限責任公司)。 儀器可在190～900 nm波長范圍內進行探測， 波長準確度±0.3 nm。

穩態熒光光譜采用的是Horiba公司生產的FluoroMax4型熒光光譜儀， 穩態熒光光譜激發波長為298 nm， 狹縫寬度設定為光譜分辨率1 nm/1 nm。 因為不同波長光源的發射功率不一樣， 且探測器在不同波長下的探測效率也不一樣， 所以我們在檢測樣品的穩態熒光光譜時選用S1c/R1c。

時間分辨熒光光譜的采集使用的時間相關單光子計數(TCSPC)設備為我們課題組自行搭建[13]， 實驗中使用的激發光源為半導體脈沖激光器(PDL 800-B， PicoQuant)， 中心波長為298 nm， 功率為1 μW， 重復頻率為10 MHz, 系統儀器響應時間分辨率為200 ps。

1.2 方法

(1)ZnSe量子點的合成及提純

ZnSe量子點的合成主要參照Zhang等[14]的研究工作， 通過水熱合成法合成出了以谷胱甘肽作為配體的水溶性ZnSe量子點， 合成所用Zn2+∶Se+∶GSH為1∶0.4∶1.3。 將22 mg硼氫化鈉和700 μL水加入5 mL的玻璃瓶中， 向其中加入15.8 mg硒粉， 使之充分反應， 得到硒氫化鈉溶液。 再將109.75 mg醋酸鋅和200 mg谷胱甘肽溶于20 mL水中， 用1 mol·L-1的氫氧化鈉調節pH值到11.5， 將反應制得的硒氫化鈉溶液加入其中， 混合溶液在100 ℃油浴下， 磁力攪拌加熱2 h， 制得ZnSe量子點原液。 將所合成的ZnSe量子點原液， 加入1.5倍體積的異丙醇， 以8 000 r·min-1離心3 min， 去除上層清液， 將所得白色固體真空干燥， 得到提純后的ZnSe量子點固體并保存于4 ℃冰箱中， 以備后續實驗使用。

(2)ZnSe量子點的表征

取上述制備的ZnSe量子點固體1 mg， 加入去離子水并稀釋至1 mmol·L-1(以Zn2+濃度計)， 得到ZnSe量子點溶液。 取1 mL所配制的ZnSe量子點溶液， 使用穩態熒光光譜儀和紫外吸收可見分光光度計測量其熒光光譜和吸收光譜。

取200 μL所配制的ZnSe量子點溶液， 滴在超薄微型銅網上， 晾干后， 采用透射電子顯微鏡對其形貌特征進行表征。

(3)ZnSe量子點在不同pH值中及與Na+相互作用的光譜表征

分別取所配制的不同pH值的0.2 mol·L-1的PBS緩沖液2 mL， 依次向其中加入配制的濃度1 mmol·L-1的ZnSe量子點溶液200 μL， 搖勻， 靜置2 min后， 采用穩態熒光光譜儀和時間單光子計數分別采集其熒光光譜和時間分辨熒光光譜。 取兩份2 mL的pH值為7的PBS緩沖液， 并分別向其中加入200 μL量子點溶液， 然后， 向其中一份加入200 μL配制的1.8 mol·L-1的NaCl溶液， 另一份加入200 μL去離子水， 分別搖勻， 靜置2 min后， 分別測定其時間分辨熒光光譜。

2 結果與討論

2.1 ZnSe量子點的表征

圖1為ZnSe量子點吸收、 熒光光譜及TEM形貌表征。 從圖1(a)可以看出， 所制備的ZnSe量子點熒光發射峰在375 nm附近且半峰寬在20 nm左右， 第一激子吸收峰在360 nm處， 該結果與文獻報道吻合。 通過透射電子顯微鏡觀察[圖1(b)]， 合成的ZnSe量子點近球形， 分散性較好， 粒徑尺寸在3 nm左右且分布較集中。 以上結果證明制備出了較好的納米級ZnSe量子點。

圖1 ZnSe量子點的熒光及紫外-可見吸收光譜(a)和透射電鏡表征圖(b)

2.2 不同pH值下的ZnSe量子點穩態熒光光譜

通過調節不同pH值的PBS緩沖液， 我們每間隔0.5， 分別測定了5～11范圍內不同pH值下ZnSe量子點的穩態熒光光譜， 在此pH值范圍ZnSe量子點能夠穩定存在， 測量的結果如圖2所示。 圖2展示了ZnSe量子點不同pH值下的熒光峰， 從圖中可以看出， 在所考察的pH值范圍內， ZnSe量子點熒光強度隨pH值的增加而增強， 變化趨勢呈正相關， 并且熒光峰伴隨pH值的增加產生稍微的紅移， 峰的位置由374 nm移動到377 nm處。 究其原因， 可能是由于在較低pH值下， 表面配體質子化從配體表面脫落， 脫離表面時帶走表面原子， 使得量子點尺寸減小， 從而在較低pH值下， 量子點發光峰波長較短。 ZnSe量子點熒光特性隨pH值的變化說明pH值對量子點的發光態具有影響， 其機制是不同pH值下， 配體具有不同的狀態[8, 15]。 相關文獻報道， 由于谷胱甘肽分子在不同pH值下， 其分子內羧基和氨基基團的質子化和去質子化程度不同， 導致谷胱甘肽配體分子在不同pH值下與Zn2+的配位結構不同[14]， 使得配體分子對量子點表面的包覆程度不同， 進而使量子點的表面出現不同狀態。 當pH值增加時, 谷胱甘肽配體分子更易去質子化， 其與Zn2+配位程度將更加緊密， 導致ZnSe量子點表面缺陷態減少， 使得ZnSe量子點熒光強度增加。

圖2 不同PH值下ZnSe量子點的穩態熒光光譜

2.3 不同pH值下的ZnSe量子點熒光動力學特性

從ZnSe量子點的穩態熒光光譜可以看出， 其熒光強度隨pH值增大而增加。 為此， 我們從熒光動力學的角度考察了pH值對ZnSe量子點熒光特性的影響。 圖3是在不同pH值下， ZnSe量子點在發射波長為375 nm處的時間分辨熒光動力學曲線。 從圖中可以看出， ZnSe量子點的熒光壽命隨pH值的增加變小。 對不同pH值下得到的熒光動力學曲線我們通過雙指數函數可以得到很好的擬合

I(t)=α1e-t/τ1+α2e-t/τ2

(1)

擬合得到兩個熒光壽命組分， 分別為一個大約為24 ns的長壽命組分τ1和一個大約為4 ns的短壽命組分τ2，α1和α2分別為熒光壽命組分的振幅， 并通過式(2)

(2)

計算得到了整體的平均壽命[16]。 圖4(a)為平均壽命隨pH值的變化曲線， 可以看出， ZnSe量子點的平均壽命隨pH值的增加而呈減小趨勢， 且pH值在6～8的范圍內， 其平均壽命隨pH值的改變最為明顯， 出現一個較大幅度的衰減。 從

圖3 ZnSe量子點在不同pH值下的熒光衰減曲線

圖4 ZnSe量子點平均壽命(a)和兩種熒光壽命組分(b)隨pH值的變化曲線

圖4(b)中可以看出， 長壽命τ1隨pH值的變化曲線和平均壽命變化曲線一致， 而短壽命τ2隨pH值的變化不明顯， 但總體有上升的趨勢。 另外， 從表1中可以看出，τ1組分占比下降，τ2組分則占比上升， 且同樣在6～8的pH值范圍內出現一個較顯著的變化。 以上實驗結果表明， pH值的改變主要影響ZnSe量子點τ1所對應的熒光衰減組分， 且在6～8的pH值的范圍內， ZnSe量子點的熒光壽命對pH值的響應較為靈敏。

表1 擬合得到的各組分的熒光壽命及其振幅

為了確認擬合得到的兩個不同的壽命的來源， 我們進一步考察了pH值分別為6， 7和8的環境下， 不同探測波長的熒光動力學并進行擬合得到熒光壽命， 其結果展示于圖5。 在三種pH值下， ZnSe量子點的τ1均隨探測波長的增加而增大， 而τ2與波長的相關性不大。 Zhao等[17]的研究結果證實， 量子點的長壽命會隨波長的變化而變化， 而短壽命則不依賴于波長的改變而改變。τ1的來源為表面態的局域載流子的復合， 而τ2則來源于核內非局域載流子的復合[16-17]。 以上分析進一步說明， pH值對量子點表面態產生了顯著影響進而導致量子點的熒光特性的改變。 對于ZnSe量子點來說， 由于表面谷胱甘肽配體對pH值敏感， pH值的改變會導致谷胱甘肽配體的質子化程度的變化， 從而影響與量子點表面的配位方式， 導致其表面狀態的改變[6]。 當pH值減小時， 谷胱甘肽配體質子化， 導致其與ZnSe量子點表面Zn2+配位緊密程度下降， 從而導致其表面態的增加， 載流子將更多的遷移到表面， 使得τ1組份增加。 另外， 由于實驗所測量的熒光衰減曲線包含輻射弛豫和無輻射弛豫， 是兩種弛豫方式綜合疊加的結果， 所以熒光衰減壽命由輻射躍遷速率Γr和無輻射躍遷速率Fnr來表示

(3)

輻射和非輻射躍遷速率的改變都會影響整體熒光壽命的改變。 通過穩態熒光實驗得到， 當pH值增加時, ZnSe量子點熒光強度上升， 說明其輻射躍遷速率Γr上升， 且無輻射躍遷速率Γnr下降[18]。 根據式(3)并結合時間分辨熒光光譜實驗結果分析得出， pH值的增加使ZnSe量子點表面態輻射躍遷速率的增加量要大于無輻射躍遷速率的減小量， 從而ZnSe量子點表面態熒光壽命隨pH值的增加而減小。

圖5 pH值為6， 7， 8時ZnSe量子點穩態熒光光譜及熒光壽命隨發射波長的變化曲線

2.4 ZnSe量子點作為pH值探針

由于ZnSe量子點熒光壽命對pH值的變化具有響應， 我們對擬合得到的兩種不同的壽命組分進行比值τ1/τ2計算， 發現其比值在不同的pH值范圍內隨pH值的變化具有一定的線性相關性， 結果展示于圖6。 從圖中可以看出， 在不同pH值范圍內，τ1與τ2的比值所呈的線性斜率不同， 在pH為6～8的范圍內， 其隨pH值變化的線性斜率最大(k=-0.63,R2=0.993)， 說明在此范圍內ZnSe量子點的壽命對pH值的變化最為靈敏， 可作為pH值探針應用于生物體系中。

圖6 ZnSe量子點熒光壽命τ1與τ2的比值隨pH值的變化

另外， 生物體系中由于存在多種金屬離子， 需要考察這些金屬離子是否會對量子點熒光壽命產生影響。 為此我們研究了生物體系中存在最多的金屬鈉離子Na+對ZnSe量子點熒光壽命的影響。 由于生物體系pH值一般在7附近， 為了與生物體系相符合， 我們在pH值為7的環境下， 測定了有無NaCl時， ZnSe量子點溶液的熒光動力學， 擬合得到平均壽命分別為24.7和24.9ns， 兩者壽命差別不大， 表明Na+對ZnSe量子點的熒光壽命影響較小。 另據文獻報道， 其他金屬離子對ZnSe量子點會產生猝滅效應， 但其猝滅方式為靜態猝滅[19-20]， 因此說明金屬離子對ZnSe量子點的熒光壽命影響不大。 綜上分析， ZnSe量子點熒光壽命對pH值的響應作為一種pH值的檢測方法應用在生物體系中具有一定的潛力。

3 結 論

通過測定ZnSe量子點在不同pH值下的熒光衰減曲線， 我們發現其在不同pH范圍內對pH具有不同的響應靈敏性。 通過擬合熒光動力學曲線， 得到兩個一快一慢的壽命組分τ1和τ2。 分析兩壽命組分各自隨pH值變化規律， 發現長壽命組分對pH值的變化響應較大， 并確定長壽命組分來源于量子點表面態發光， 說明ZnSe量子點熒光壽命對pH值的響應主要因其表面狀態的改變。 另外，τ1和τ2的比值在不同pH值范圍內具有一定的線性相關性， 且在不同pH值范圍內線性斜率不同， 在pH值為6～8的范圍內具有最大的線性斜率， 表明在此范圍內其熒光壽命對pH值的變化最為靈敏。 由于熒光壽命相較于穩態熒光強度不受溶液濃度及強度等影響， 所以ZnSe量子點熒光壽命對pH值的響應特性在生物體系pH值檢測中具有良好的應用前景。