骨肉瘤化療敏感性相關基因研究進展

楊貴 田征

作者單位：830000 烏魯木齊，新疆醫科大學第一附屬醫院骨腫瘤科

在過去的幾十年中，癌癥研究發展迅速，化療的出現可以提高大多數癌癥的生存率。盡管靶向治療和免疫治療等新的治療方式已開始在某些腫瘤中取得不錯的治療效果，但化學治療仍是幾乎所有癌癥類型的全身治療方案之一。盡管當今有各種各樣的化學療法可供選擇，但是對于大多數患者而言，耐藥性仍然是一個嚴重的問題。骨肉瘤化療耐藥的機制目前尚不明確，可能跟以下途徑有關：DNA 拓撲異構酶的活性改變，谷胱甘肽轉移酶 ( GST ) 的活性增高，膜運輸功能障礙，自噬激活以及 DNA 損傷修復增強等[1]。隨著藥物基因組學逐漸被視為個性化醫療的工具，并且可以預測癌癥患者對化學療法的反應及臨床結果[2]，越來越多的學者開始從基因角度去分析與化療敏感性相關的基因，以求找到化療耐藥的解決辦法。筆者將對具有代表性的骨肉瘤化療敏感性相關基因研究進展作一綜述。并根據骨肉瘤化療主要藥物將其歸納為阿霉素、順鉑、甲氨蝶呤、多藥耐藥相關基因幾大類。

一、阿霉素相關基因

1. DNA 損傷修復相關基因 ( PARP1、SIRT6 )：很多抗腫瘤藥物的作用機制都是通過破壞 DNA 的結構來促進細胞凋亡，因此，DNA 損傷修復增強可能是腫瘤產生耐藥性的重要原因之一。據最新研究報道，目前與化療耐藥相關的 DNA 修復機制主要包括：核苷酸切除修復 ( NER )、堿基切除修復 ( BER ) 以及同源重組修復 ( HRR )[1]。PARP1 和 SIRT6 都是 BER 途徑的重要蛋白，已經證明在骨肉瘤細胞系中應用 PARP1 抑制劑奧拉帕利下調 PARP1表達時，骨肉瘤細胞對阿霉素的敏感性明顯提高[3]。因此，PARP1 基因可能是改善阿霉素敏感性的靶點基因。最近的研究進一步證實了這一觀點，該研究發現 SIRT6 可以通過激活 PARP1 來介導 DNA 損傷修復途徑，抑制 SIRT6時，可以增強阿霉素對骨肉瘤細胞的敏感性，同樣應用PARP1 抑制劑奧拉帕利可以減輕 SIRT6 過表達導致的阿霉素耐藥[4]。PARP1 抑制劑奧拉帕利目前已被國家藥品監督管理局 ( CFDA ) 正式批準用于治療鉑敏感復發性卵巢癌維持治療，未來能否在骨肉瘤中應用有待進一步研究。

2. 低氧相關基因 ( PI3K、NF-κB、AMPK )：缺氧存在于骨肉瘤化療耐藥的機制中，缺氧會降低 MG-63 或 U2-os骨肉瘤細胞對阿霉素的敏感性，但是目前尚無缺氧導致化療耐藥的確定機制[5]。先前的研究發現磷酸肌醇 3 激酶 ( PI3K ) 途徑和核因子 κB ( NF-κB ) 通過抑制藥物誘導的細胞凋亡參與低氧誘導的耐藥性[6]。最近的研究表明，AMPK 在缺氧誘導的骨肉瘤細胞對阿霉素的抗性中起關鍵調節作用，低氧通過激活 AMP 激活的蛋白激酶 ( AMPK )信號傳導可以促進骨肉瘤細胞的耐藥性，抑制 AMPK 活性時，可以降低缺氧誘導的骨肉瘤對阿霉素的耐藥性[7]。因此 PI3K、NF-κB 和 AMPK 基因都是骨肉瘤化療敏感性的重要基因，抑制這些基因的表達或者抑制基因調控的相關途徑可能是改善阿霉素耐藥的新方法。

3. 自噬相關基因 ( HMGB1、HMGN5、PTEN )：自噬是溶酶體蛋白水解的一種機制，可以通過分解細胞成分，產生細胞存活所需的代謝物質，從而促進細胞的存活以達到化療耐藥的作用[8]。HMGB1 是晚期炎癥的標志物，可持續促進炎癥因子的釋放，從而不斷觸發炎癥反應，導致細胞損傷或壞死而改變自噬及凋亡水平[9]。先前的研究發現，阿霉素，順鉑和甲氨蝶呤均可上調骨肉瘤細胞 MG-63，Saos-2 和 U2-OS 中 HMGB1 mRNA 的表達，抑制 HMGB1 基因表達時，能夠恢復細胞系 MG-63 和 Saos-2的化學敏感性；另一項研究表明，骨肉瘤細胞系的化療耐藥性既依賴于 HMGB1，也依賴于 HMGN5，當激活自噬過程時，可以促進 HMGB1 和 HMGN5 的表達，從而誘導化療耐藥，而抑制自噬過程則可以下調 HMGB1 和 HMGN5的表達，并促進骨肉瘤對化療敏感[1]。因此，HMGB1 和HMGN5 基因都是與自噬相關的可以影響骨肉瘤化療敏感性的重要基因，但是具體機制仍不明確，這些基因是否可以用作治療靶點仍有待研究。但是，最新的研究發現，除了 HMGB1 和 HMGN5 基因之外，與自噬相關的其他基因，比如 PTEN 也已被證明與骨肉瘤阿霉素敏感性相關。PTEN 是一種抑癌基因，可以抑制 PI3K / AKT / mTOR 信號通路，早期的研究發現，PTEN 可以通過促進細胞自噬降低化療敏感性；最近的研究表明 miR-155 通過抑制 PTEN表達，增強 PI3K / AKT / mTOR 信號通路，從而抑制阿霉素誘導的細胞凋亡和自噬，并降低對阿霉素的敏感性[10]。因此，PTEN-PI3K / AKT / mTOR 信號通路 - 自噬可能是潛在的治療化療耐藥的途徑。

4. 抑制細胞凋亡和細胞周期調控相關基因 ( PHB、rhoA、Bcl-2、STAT3 )：細胞周期停滯通過允許細胞在進入細胞周期之前修復 DNA 損傷來延遲細胞凋亡。因此，凋亡或細胞周期信號轉導的改變可能會導致腫瘤細胞對化療的抵抗[1]。先前的研究表明，PHB ( 一種抗增殖蛋白 )和 rhoA ( 參與凋亡 ) 基因的過度表達將骨肉瘤藥物敏感性分別降低至約 52% 和 59%，說明了其在骨肉瘤化學敏感性中的重要性。此外 Bcl-2 也被證明是影響骨肉瘤阿霉素敏感性的重要基因。利用慢病毒介導的 RNA 干擾抑制 Bcl-2會增加對阿霉素的敏感性。因此，Bcl-2 抑制劑可能是治療骨肉瘤阿霉素耐藥的可行方法。Venetoclax 是一種特異性的 Bcl-2 抑制劑，在治療復發或難治性慢性淋巴細胞性白血病 ( CLL ) 方面具有良好的反應率，且毒性可控[1]。在人骨肉瘤細胞系中將其與阿霉素聯合使用來改善耐藥也是一種不錯的選擇。

最近的研究表明，阿帕替尼可通過抑制轉錄激活因子3 ( STAT3 ) 信號轉導，抑制轉錄因子 Sox2 的表達，從而降低了阿霉素誘導的骨肉瘤化療耐藥性[11]。這暗示了 STAT3在骨肉瘤阿霉素耐藥性中的重要作用。另一項研究表明，抑制 STAT3 可以通過增加藥物吸收和消除藥物外排而增加耐藥骨肉瘤細胞對阿霉素的敏感性。該研究還發現 MDR1( 多藥耐藥蛋白 ) 是 STAT3 的下游靶標[12]，MDR1 已被公認為是引起化療耐藥的重要原因，因此，STAT3 / MDR1信號轉導軸將是改善化療耐藥的重要靶點。已經證明在體外和體內，STAT3 / MDR1 信號轉導軸抑制劑 Raddeanin A 可以明顯提高骨肉瘤細胞對阿霉素的敏感性[12]。而另一項研究還發現，淫羊藿苷通過阻斷 STAT3 磷酸化，從而抑制 MDR1 和 MRP1 的表達，最終恢復了耐阿霉素骨肉瘤細胞的化療敏感性[13]。這些研究給阿霉素耐藥患者的治療帶來了希望，Raddeanin A、淫羊藿苷等 STAT3 /MDR1 軸抑制劑聯合阿霉素治療骨肉瘤化療耐藥將是未來值得研究的方向 ( 圖1 )。

圖1 阿霉素耐藥相關基因Fig.1 Genes related to doxorubicin resistance

二、順鉑相關基因

1. DNA 損傷修復相關基因 ( FoxM1 )：順鉑是一種細胞毒性藥物，通過促進 DNA 的嘌呤形成具有親核位點的二價化合物，從而導致 DNA 鏈內交聯，引起 DNA 雙鏈斷裂，最終誘導細胞的凋亡[14]。因此，順鉑耐藥性最常見的原因是 DNA 修復機制的改變。同源重組可以修復 DNA 雙鏈斷裂、單鏈 DNA 缺口、DNA 內部或鏈間交聯[15]。同源重組修復 DNA 的能力增強時可能參與骨肉瘤順鉑耐藥機制。已經證明 Rad51 是同源重組修復的關鍵蛋白，在腫瘤中高表達，參與化療耐藥[16]。在骨肉瘤中，朱霞等[17]發現，抑制 FoxM1 可以通過下調 Rad51 表達從而增加骨肉瘤細胞對化療的敏感性。并且應用 FoxM1 特異性抑制劑Thiostrepton ( 硫鏈絲菌肽 ) 處理骨肉瘤的耐藥細胞系時發現耐藥細胞增殖明顯下降。因此，FoxM1 / Rad51 可能是一個潛在的改善順鉑耐藥的治療靶點。

2. 細胞內藥物修飾相關基因 ( GSTP1 )：藥物進入細胞后保持活性是至關重要的，這樣才能在靶細胞中發揮作用。谷胱甘肽 -S- 轉移酶 ( GSTs ) 是一個 Ⅱ 期解毒酶家族，可以催化谷胱甘肽 ( GSH ) 與多種可進入細胞的化合物結合，導致其失活，從而達到解毒作用。已經發現GSTP1 與很多癌癥的化療耐藥性有關，在人類骨肉瘤細胞中，GSTP1 過表達會導致腫瘤細胞對阿霉素和順鉑的耐藥性增加；而 GSTP1 的抑制劑 NBDHEX 已經發現可以增加骨肉瘤耐藥細胞對順鉑的敏感性，從而與順鉑發揮協同的抗腫瘤作用[1]。因此，GSTP1 抑制劑可能成為改善順鉑耐藥的靶向藥。

3. 癌基因 ( CCN2 )：癌基因或抑癌基因是影響細胞增殖和凋亡的重要基因，并在化療耐藥中扮演重要角色。早期研究發現 CCN2 可能是人類骨肉瘤對順鉑耐藥的關鍵癌基因。在人類骨肉瘤細胞中，CCN2 通過 Bcl-xL 和 survivin的上調抑制順鉑誘導的細胞凋亡和促進腫瘤細胞存活從而增強了患者對順鉑的耐藥性[18]，而 Bcl-xL 和 survivin 也已經被證明可以通過抑制細胞凋亡來減弱骨肉瘤的化療敏感性[19-20]。這揭示了 CCN2 在骨肉瘤化療耐藥中的重要作用，Bcl-xL 和 survivin 可能是其促進耐藥的最終靶點。但是，最新的一項研究發現，CCN2 同時可以通過影響轉運蛋白 ABCG2 促進骨肉瘤耐藥。CCN2 通過下調 miRNA-519d 來增加 ABCG2 表達并促進骨肉瘤耐藥性[21]，而ABCG2 已被發現有助于骨肉瘤的多藥耐藥性[1]。這從另一個角度解釋了 CCN2 導致的耐藥，未來可能還會發現其他影響耐藥的途徑，但不管怎樣，CCN2 都是影響化療敏感性的重要基因。

4. 抑癌基因 ( PTEN、PPARγ )：上文提到很多癌基因參與骨肉瘤對順鉑耐藥，同樣，抑癌基因也是影響骨肉瘤順鉑敏感性的重要基因，比如 PTEN、PPARγ。Mxd1 是Myc / Max / Mxd 家族的成員，被證明參與低氧環境下的耐藥性發展。低氧誘導的 Mxd1 通過直接抑制 PTEN，從而激活 PI3K / AKT 的抗凋亡和生存途徑，促進骨肉瘤細胞對順鉑的抵抗[22]。因此 Mxd1-PTEN-PI3K / AKT 軸可能治療骨肉瘤順鉑耐藥的潛在靶點。此外，最新的研究報道，PPARγ 激動劑吡格列酮不僅可以克服骨肉瘤患者原位異種移植 ( PDOX ) 模型中的阿霉素抗性，同時還可以克服順鉑耐藥的骨肉瘤 PDOX 模型。PPARγ 激動劑吡格列酮與順鉑聯用時，與單獨使用順鉑治療的骨肉瘤 PDOX 模型相比，可以明顯抑制腫瘤細胞生長，促進腫瘤細胞凋亡[23]。這給那些既耐阿霉素，又耐順鉑的患者帶來了希望，PPARγ 激動劑不僅可以與阿霉素，同時還能與順鉑發揮協同抗腫瘤作用，未來能否與骨肉瘤化療藥聯合使用以增加骨肉瘤化療敏感性值得進一步的研究。

5. 自噬相關基因 ( beclin1、ATG4B )：beclin1 和ATG4B 基因都是自噬基因，早期的研究發現通過抑制beclin1 基因的表達，導致自噬的抑制，從而增加了骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性[24]。最近的研究表明 ATG4B 的過表達促進順鉑誘導的自噬并抑制細胞凋亡，從而增強骨肉瘤細胞系中的順鉑耐藥性[25]。因此，自噬相關基因除了參與前文所講的阿霉素敏感性之外，也參與順鉑敏感性。抑制與自噬相關的基因表達可能是改善骨肉瘤阿霉素和順鉑耐藥的不錯選擇 ( 圖2 )。

圖2 順鉑耐藥相關基因Fig.2 Genes related to cisplatin resistance

三、甲氨蝶呤相關基因

1. 藥物轉運相關基因 ( RFC、FOLT )：甲氨蝶呤是二氫葉酸還原酶 ( DHFR ) 的抑制劑，與葉酸結構相似，通過抑制二氫葉酸還原成有生理活性的四氫葉酸，從而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成過程中一碳基團的轉移作用受阻，導致 DNA 的生物合成受到抑制[26]。甲氨蝶呤的運輸受損是骨肉瘤細胞耐藥的常見機制，還原性葉酸載體 ( RFC ) 是介導甲氨蝶呤 ( MTX ) 轉運至細胞內的重要物質，在骨肉瘤細胞中，當 RFC 出現功能障礙或者表達下降時，都導致了 MTX 耐藥的產生[1]。因此，RFC 活性將是影響骨肉瘤對甲氨蝶呤敏感性的重要因素，激活 RFC 基因的過表達可能是提高甲氨蝶呤敏感性的有效手段之一。

FOLT 基因是一種葉酸轉運基因，先前的研究表明，當 FOLT 活性增強時可以明顯促進 MTX 轉運至細胞內，從而提高 MTX 的細胞毒作用[27]。最近的研究進一步證明了在骨肉瘤細胞中，FOLT 的下調表達是引起骨肉瘤 MTX耐藥的重要因素之一[28]。因此 FOLT 基因也是改善骨肉瘤MTX 敏感性的重要基因 ( 圖3 )。

圖3 甲氨蝶呤與多藥耐藥相關基因Fig.3 Genes related to methotrexate and multidrug resistance

2. FPGS 基因：葉酰聚谷氨酸合酶 ( FPGS ) 是 MTX 和葉酸相互作用的關鍵酶，催化 MTX 形成具有活性的甲氨蝶呤多聚谷氨酸復合物 ( MTX-PG )，從而發揮 MTX 的細胞毒作用[29]。因此 FPGS 活性的改變可能是影響腫瘤對MTX 敏感性的重要因素，一項最新的研究支持了這一觀點。該研究發現在骨肉瘤細胞系中，紡錘體和動粒關聯蛋白-1 ( SKA1 ) 的過表達通過與 RNA 聚合酶 Ⅱ 亞單位 RPB3的相互作用導致了 FPGS 下調，從而導致了甲氨蝶呤的耐藥性，而抑制 SKA1 的表達能夠恢復藥物敏感性[30]。

四、多藥耐藥相關基因

1. MDR 基因 ( MDR1 )：MDR 蛋白也叫多藥耐藥相關蛋白，MDR 蛋白通過將細胞內的化療藥物轉運至細胞外，使細胞內藥物濃度降低，從而導致多藥耐藥的發生[31]。此外，MDR 蛋白還可以通過增加促凋亡蛋白的活性，間接抑制化療藥物所致的細胞凋亡[32]。MDR1 也被稱為 P 糖蛋白 ( P-gp ) 或者 ABCB1 蛋白，是最先發現的 MDR蛋白，作為一種依賴 ATP 的膜轉運體，可以直接將藥物從細胞內轉運至細胞外，使細胞內藥物濃度降低，導致耐藥性的產生[33]。研究表明 P-gp 的過表達與骨肉瘤產生多藥耐藥密切相關[34]，此外很多基因還可以通過調節 MDR1基因的表達間接導致骨肉瘤多藥耐藥的產生，這些基因包括 Notch1、P28GANK、Trps1 等[35-37]。因此抑制 MDR1 的表達將是改善骨肉瘤多藥耐藥的關鍵措施。近年來，已經開始研究通過下調或抑制 MDR1 基因的表達來改善骨肉瘤化療敏感性的靶向藥物，比如吡格列酮、粉防己堿以及堿性磷酸酶抑制劑 NVP-TAE684 等[38-40]，這些研究均取得了不錯的效果。相信在未來通過大量臨床藥物試驗的驗證，這些可以下調 MDR 蛋白表達的藥物將會是治療骨肉瘤多藥耐藥的重要手段。

五、小結與展望

本文從基因角度闡述了與骨肉瘤化療敏感性相關的重要基因，并進一步分析這些基因影響化療敏感性的機制，除了已經被廣泛認可的常見機制，比如 DNA 損傷修復增強，自噬激活，膜轉運功能障礙，多藥耐藥蛋白的表達等之外，最新的研究還發現，低氧誘導的化療耐藥以及與細胞凋亡和細胞周期調控相關的基因也與化療敏感性相關。激活或抑制這些化療敏感性相關基因的靶向藥已顯示出可以促進相關化療藥物的細胞毒作用，比如通過下調或抑制 MDR1 基因的表達來改善骨肉瘤化療敏感性的靶向藥物吡格列酮、粉防己堿以及堿性磷酸酶抑制劑 NVP-TAE684等。有的藥物甚至已經被批準用于臨床治療，比如 PARP1抑制劑奧拉帕利目前已被國家藥品監督管理局 ( CFDA ) 正式批準用于治療鉑敏感復發性卵巢癌維持治療。因此，針對這些化療敏感性相關基因影響化療耐藥的機制研發出有效的可以增加骨肉瘤化療敏感性的靶向藥，聯合傳統化療藥物進行治療可能是未來進一步提高骨肉瘤患者生存率的一種有效措施，這有望使我們打破骨肉瘤治療長達近四十年的停滯狀態。