兩株耐寒PGPB的分離及其對藏北當地牧草生長的影響

何敏 王秀璞 李彥 戴志聰 王從彥 杜海 杜道林

摘 要：為了從青藏高原北部（簡稱藏北）退化草原的土壤中分離篩選可以促進當地典型牧草生長的促生菌株，以促進藏北植被修復。該文通過采用稀釋涂平板的方法，分離耐低溫植物促生菌株，并結合盆栽試驗設計，評估分離細菌對當地牧草生長的影響。結果表明：（1）從西藏土壤中成功篩選得到兩株耐低溫細菌TS22和TS27，經16S rRNA基因鑒定分別屬于Brevibacterium sp.和Bacillus mycoides。（2）通過離體評估兩株分離菌植物促生屬性的結果顯示，菌株TS22和TS27均具有產生IAA、SID的能力和ACC-脫氨酶活性，TS22具有較高的ACC-脫氨酶活性（264.69 nmol·α-KB mg-1·h-1），TS27顯示出較強的產IAA[（7.52±3.85）mg·L-1]和SID（92%）的能力。（3）盆栽試驗顯示，在10 ℃低溫環境下，菌株TS22和TS27對早熟禾和老芒麥生長的影響因植物和菌種的不同而有所不同;菌株TS22在株高、根長、地上和地下干重方面顯著促進了早熟禾的生長，且促生能力優于TS27。該研究結果為植物-微生物技術在藏北高寒地區植被恢復中的使用提供了很好的菌種資源和實踐基礎。

關鍵詞：植物促生菌，低溫環境，耐低溫菌，植物促生屬性，植物修復，草原退化

中圖分類號：Q945

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）09-1425-08

Abstract：The objective of this study was to screen cold-tolerant plant growth-promoting bacteria （PGPB）for local typical grass in Northern Tibetan Plateau. The serial dilution plating method was used to isolate the PGPB，and pot experiment was designed to evaluate the effect of isolated PGPB on the growth of local grass. The results were as follows：（1）In total，two cold-tolerant PGPB strains named TS22 and TS27 were obtained，which were identified as Brevibacterium sp. and Bacillus mycoides respectively by 16S rRNA gene sequence analysis. （2）Both two strains could produce IAA，SID and ACC-deaminase activity. Strain TS22 showed high ACC-deaminase activity （264.69 nmol·α-KB mg-1·h-1），TS27 displayed higher IAA[（7.52±3.85）mg·L-1] and SID （92%）production ability. （3）Under low temperature （10 ℃），these two isolated PGPB exerted different effects on the growth of Poa annua and Elymus sibericus. Inoculation of strain TS22 significantly improved the growth of Poa annua in plant height，root length，aboveground dry weight，underground dry weight，and showed greater plant growth-promoting activity than strain TS27. This study provides valuable strain resources and experimental basis for application of plant-microbe technique in vegetation restoration in Northern Tibetan Plateau.

Key words：plant growth-promoting bacteria，low-temperature environment，low-temperature-tolerant bacteria，plant growth-promoting properties，plant phytoremediation，grassland degradation

近年來，藏北高原地區由于過度放牧導致草地植被日益退化，已嚴重威脅當地生態生物多樣性、環境健康質量、當地經濟發展和人類生活質量水平。因此，加強草地植被保護和修復受到越來越多的關注（Wang et al.，2019）。通過添加化肥、堆肥、高分子材料和腐殖酸等方法，雖然可以有效提高植被修復效率，但因成本高難以實現大規模修復。

PGPB是一類可以直接或間接改善植物健康而促進植物生長的細菌（Bashan & Holguin，1998），可以通過固氮、產吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、鐵載體（siderophore，SID），產ACC-脫氨酶活性（ACC-deaminase activity，ACC）和溶解不溶性磷酸鹽等方式增加植物營養吸收，或者分泌抗生素等物質，保護植物免受病原菌入侵。目前，PGPB已被廣泛應用于農業生產中，如從印度喜馬拉雅山脈的莧菜（Amarantus sp.）根際分離出來的耐低溫假單胞菌（Pseudomonas sp.），具有產IAA、SID以及溶解磷酸鹽等植物促生（plant growth-promoting，PGP）屬性，使小麥幼苗的發芽率、株高和根長分別提高了19.2%、30.0%和22.9%（Mishra et al.，2009）。此外，PGPB在生態環境修復領域還表現出很大的潛力，尤其在特殊極端環境的植被修復方面，如PGPB（Azospirillum）與仙人掌在墨西哥等地沙漠治理的作用效果得到前期研究的證實。接種Azospirillum的仙人掌種子可以在不加肥料的碎石中生長良好，而未接菌的植株則枯萎甚至死亡（Bashan & de-Bashan，2010a）。采用PGPB可以改善土壤侵蝕區的植物健康和生長性能，增強其對干旱和鹽堿等脅迫的耐受性，有助于脆弱生境原位植被再生，而無需額外添加化學肥料，降低了生物修復的成本。然而，將PGPB應用于促進西藏高寒草原牧草生長、修復當地植被的研究尚未見有報道。

鑒于藏北高寒脆弱生境條件的特殊性和土著微生物的影響，外源添加PGPB作用效果會受到限制。本研究從采集的西藏土壤中分離、篩選土著耐低溫PGPB，并在室內模擬藏北低溫條件，以藏北高原廣泛分布的兩種本地禾本科牧草早熟禾（Poa annua）和老芒麥（Elymus sibericus）為試驗植物，對分離菌株的植物促生效果進行評價。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

土壤樣品采集于西藏那曲地區申扎縣（88°37′—88°38′ E 、30°55′—30°56′ N），土壤類型以高寒草原土為主。采用5點混合取樣方法，取樣深度0～10 cm，重復3次。清除采集的土壤樣品中的礫石和植物殘渣后，將土壤樣本放入消毒密封的聚乙烯袋中，帶回試驗室，每份土壤樣品稱取50 g，送樣南京卡文思檢測技術有限公司（Convinced-Test）進行土壤理化性質檢測分析。其余土壤儲存在-20 ℃冰箱中以便后續進行細菌分離。土壤樣品的營養成分如表1所示。

1.2 耐低溫菌的分離鑒定

將0.1 g土樣放入裝有1 mL磷酸鹽緩沖液的離心管中，250 r·min-1、25 ℃振蕩30 min后，對懸浮液進行梯度稀釋。取100 μL稀釋后的懸浮液于Luria-Bertani（LB）平板培養基涂布，置于低溫環境（4 ℃）下培養，進行耐低溫菌分離 （Reasoner & Geldreich，1985）。培養7 d后，挑取單克隆，轉移到新鮮LB瓊脂培養基上進行純化驗證。收集分離純化后的菌株，提取總DNA，用細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-ACGGTACCTTGTACGACTT-3′）進行16S rRNA基因序列PCR擴增，所得PCR擴增產物經驗證后送上海生工公司測序。將測序所得序列與EzBiocloud數據庫中的序列進行比對。利用MEGA 6.06中的鄰位連接法，構建系統發育樹。

1.3 PGPB植物促生屬性分析

對分離菌株的促生特性進行了評價。根據Glickmann & Dessaux （1995）描述的方法，對分離菌株的產IAA能力進行檢測。將菌株接種在含L-色氨酸的R2A培養基中，孵育72 h后，離心收集無菌上清液，用比色微板法測定培養基上清液中IAA在OD530 ?nm波長處的吸光值，并繪制IAA的標準曲線以定量分析。

按照Penrose & Glick （2002）提出的方法進行ACC脫氨酶活性的定量測定。將細菌菌體在不含硫酸銨的DF培養基中培養8 h，離心收集沉積的細菌細胞;將收集的細胞重新懸浮在添加3.0 mmol·L-1 ACC的DF培養基中，孵育24 h后，用比色法測定酶活性。

根據Cherif-Silini et al. （2016）描述的方法定量測定SID的產量。在KingB培養基中培養72 h后，離心收集500 μL上清液，與500 μL鉻天青S測定混合溶液。在630 nm波長處測定混合物的吸光值。SID的百分比按以下公式計算：ST-SeST×100%。式中，ST是深藍的CAS溶液的吸光值（對照），Se是從藍色變為橙色的樣品的溶液吸光值。

為檢測菌株溶解不溶性磷酸鹽的能力，將分離菌菌懸液分別點接于含有不溶性磷酸鹽Ca3（PO4）2的Pikovskay瓊脂平板的中心，置于28 ℃培養箱（馮瑞章等，2005）。通過觀察菌落周圍有無透明圈和測量透明圈的大小，來分析分離菌的溶解不溶性磷酸鹽的能力，并判斷它的有無及強弱。上述所有指標的測定均設置3個重復。

1.4 盆栽試驗

首先，用75%乙醇溶液浸泡1 min和5% NaClO溶液浸泡5 min對早熟禾和老芒麥的種子進行表面滅菌處理，經滅菌水清洗3次后，滅菌種子分別用10 mL濃度為108 cfu·mL-1的菌懸液浸泡2 h，對照處理用滅菌磷酸鹽緩沖液。然后，將種子播種在裝有180 g滅菌砂的培養瓶中，加入54 mL的0.5倍改良霍格蘭溶液，并在溫室（25 ℃）中培養。根據西藏土壤礦物鹽組成（表1）改良了Hoagland營養液，配方如下：94.5 g·L-1 Ca（NO3）2·4H2O，50.6 g·L-1 KNO3，8 g·L-1 NH4NO3，0.002 76 g·L-1 KH2PO4，49.3 g·L-1 MgSO4·7H2O，3.73 g·L-1EDTA-2Na，2.78 g·L-1FeSO4·7H2O，0.83 mg·L-1 KI，22.3 mg·L-1 MnSO4，0.25 mg·L-1Na2MoO4，0.025 mg·L-1CoCl2，6.2 mg·L-1 HBO3，8.6 mg·L-1ZnSO4和 0.025 mg·L-1 CuSO4（pH 6.0）。最后，種子萌發后，將幼苗移至低溫（10 ℃）、光照強度為10 000 lx（光暗=14 h/10 h）的條件下培養（本試驗采用的栽培條件是依據青藏高原6月份的平均溫度、日照強度和日照時數而確定）。每個處理設置5個重復。

培養30 d后，收獲植株。測量植株的株高、根長、地上鮮重、地下鮮重、地上干重和地下干重。

1.5 數據分析

采用IBM SPSS Statistics 20統計軟件進行統計分析，對記錄的數據進行單因素方差分析和雙因素方差分析，以P值的大小評價其顯著性。所有圖示均由Origin軟件（2018版）繪制。

2 結果與分析

2.1 耐低溫細菌的分離鑒定

從西藏土壤中，最終成功分離得到TS22和TS27兩株細菌。將所測得的分離菌株的16S rRNA基因序列與EzBiocloud數據庫中的序列進行比對，確定菌株的分類學地位，構建系統發育進化樹（圖1），菌株TS22與Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801具有最高相似性，為96%，因此初步鑒定其為Brevibacterium屬的新種。菌株TS27與Bacillus mycoides DSM 2048具有最高相似性，為99%，因此該菌株分類為B. mycoides。菌株TS22、TS27的16S rRNA基因序列均已提交GenBank，獲得登錄號分別為MN710445、MN710449。

2.2 分離菌株植物促生屬性檢測

對這兩株細菌的植物促生屬性進行了檢測，包括產IAA、溶解不溶性磷酸鹽、產SID和ACC脫氨酶活性（表2）。表2結果顯示，菌株TS22具有極高的ACC脫氨酶活性（264.69 nmol·α-KB mg-1·h-1），是菌株TS27的10倍。TS22、TS27均不具有溶磷能力，同時產IAA能力較低，分別為（3±0.31）、（7.52 ± 3.85）mg·L-1。菌株TS22、TS27具有較高的產SID能力，分別為89.58%±0.08%、92.74%±0.24%。

2.3 分離菌株對本地牧草生長的影響

如圖2、圖3所示，接種菌株TS22和TS27對當地牧草早熟禾和老芒麥的生長影響各不相同。如圖2所示，與不接種的對照組相比，接種TS22顯著提高了一年生早熟禾的株高、根長、地上和地

下部分干重。接種TS27的早熟禾株高、 根長、 地上和地下部分干重與不接種對照組相比，分別增加了20.7%、11.1%、89.4%和74.2%，但在統計學上不具有顯著差異。

如圖3所示，接種TS22和TS27沒有明顯的促進作用，甚至有輕微抑制作用。接種TS22使老芒麥地上和地下干重分別降低了1.4%和5.4%。而接種TS27的處理顯著縮短了22%的根長。

2.4 分離菌株與植物生長屬性的相關性分析

雙因素方差分析結果表明，植物種類僅對地下鮮重、干重有顯著影響，細菌種類對所有植物生長指標都有影響;植物和細菌交互協同作用，對植物生物量相關的指標有影響（表3）。

3 討論與結論

在利用PGPB進行退化土壤植被再生修復的過程中，微生物菌劑的選擇具有決定性作用。對于條件苛刻的特殊生境，接種外源PGPB菌劑到特殊生境會受到來自生存環境巨大變化和本土微生物競爭的雙重挑戰，從而限制了外源PGPB接種劑的存活及功能活性。選擇土著PGPB作為接種劑，可以更好適應本土環境，有助于發揮預期效果（Schlaeppi et al.，2016）。

本研究針對藏北地區獨特的地理環境和寒冷干燥的氣候特征，從藏北土壤中分離到兩株耐低溫植物促生菌，Brevibacterium sp. TS22和Bacillus mycoides TS27。許多Bacillus屬的細菌被發現具有植物促生功能（Santoyo et al.，2012），但關于Brevibacterium屬菌的植物促生功能鮮有報道。Wang et al. （2016）從青藏高原細葉嵩草中分離篩選到Brevibacterium屬的內生菌，該菌被檢測發現具有多種植物促生特性，但該報道尚未對該分離菌進行進一步功能驗證。 Meena et al. （2017）從庫拉索蘆薈根際中成功分離到一株具有多種植物促生屬性的Brevibacterium frigoritolerans SMA23，在10 ℃低溫下對小麥生長有積極影響。通過對分離菌產IAA、SID、ACC-脫氨酶等植物促生性能的檢測發現，兩株分離菌株均可以產IAA、SID和ACC-脫氨酶，并且TS22具有高效ACC-脫氨酶活性（264.69 nmol·α-KB mg-1·h-1），TS27具有更高的產IAA[（7.52±3.85）mg·L-1]和SID（92%）能力。 IAA是一種常見的植物促生長激素，Gonita-Mishra et al. （2017）報道了38株分離菌，其中89.47%的菌株能產生顯著的IAA（4.7～77.41 mg·L-1）。作為一種高效的植物生長激素，較高的IAA產量能夠引起幼苗的形態和生理變化（Masciarelli et al.，2013）。SID在植物根系鐵的生物有效性中起著重要作用（Sorty & Shaikh，2015）。其與植物根際的鐵具有很高的親和力，能結合根際環境中大部分的有效鐵，與此同時限制了根部病原微生物對有效鐵的利用，起到了抑制病原菌增殖的效果（O′Gara，1992）。細菌產ACC-脫氨酶降低植物乙烯水平，緩解各類脅迫，是這些細菌發揮作用的關鍵組成成分，包括保護植物免受洪水、干旱、鹽分、花卉枯萎、金屬、有機污染物以及細菌和真菌病原體的侵襲（Glick，2014）。本研究中分離到耐低溫菌株TS22和TS27不但能適應青藏高原寒冷高海拔環境，且具有不同程度的植物促生潛力，為后續藏北高原植被再生提供了寶貴的菌種資源。

當把TS22和TS27接種到藏北本地牧草早熟禾和老芒麥植物根際時，菌株TS22對早熟禾植株表現出明顯的生長促進作用，而對老芒麥的生長沒有明顯促進效應;菌株TS27則對兩種禾草的促生作用均不明顯。已有研究表明，并非所有具有PGP特性的細菌都能對植物的生長產生積極影響，菌-植互作的環境與寄主植物及菌劑的種類均會影響植物促生的效果（de-Bashan et al.，2012）。同時，PGPB促進植物生長是一個復雜的過程，涉及不同促生屬性間的協同作用。Bashan & de-Bashan（2010b）通過對兼有多種植物促生特性的PGPB菌株Azospirillum brasilense的作用機制研究發現，A. brasilense的作用機制并非單一，在一定環境條件下這些促生機制同時或相繼運行。本研究的盆栽結果表明植物生長效果因植物和細菌種類的不同而有差異。菌株TS22所表現的多種促生屬性間的協同模式可能更適合早熟禾植株的生長。由此可見，對于不同植株選擇恰當的PGPB很重要，應根據接種試驗效果進行有目的篩選，有關PGPB-宿主植物相互作用的機制研究有待于進一步挖掘。

綜上所述，本研究在藏北高原特殊環境條件下分離篩選到可以有效促進當地牧草生長的低溫植物促生菌，為后續植物-微生物技術在藏北高寒地區的植被修復應用提供了寶貴的菌種資源和應用基礎。

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（責任編輯 蔣巧媛）