EGFR基因19外顯子del18bp突變檢測技術平臺的構建及優化

蔣艷芳，譚 黎，向花花，文小莎，郭紫芬

(南華大學 藥物藥理研究所 湖南省分子靶標新藥研究協同創新中心 湖南省腫瘤微環境響應藥物研究重點實驗室，湖南 衡陽 421001)

研究顯示，在包括肺癌在內的各種腫瘤中都存在一定程度的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)過表達，EGFR已成為相關腫瘤尤其是肺癌化療研究的重要靶標[1-2]。多數非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者中均可檢測到EGFR基因突變，肺癌經確診后的5年生存率較低[3]。因此，早發現、早診斷和早治療是提高肺癌生存率的關鍵。肺癌的基因突變一直是近年來的研究熱點[4-5]，現有證據表明，EGFR基因突變可能與EGFR靶向藥物TKI的敏感性密切相關[6-8]。EGFR基因酪氨酸激酶區域存在的多種突變能夠很好地預測TKI的治療效果，如《科學》雜志[9]和《新英格蘭醫學雜志》[10]曾報道EGFR基因突變與吉非替尼療效關系密切。本實驗擬采用普通PCR及重疊PCR對肺癌EGFR基因19外顯子的del18bp(Del L747-P753 ins突變)進行體外重組，即將D18MT基因片段插入pDM19-T質粒中構建突變型重組載體，以提供后續實驗基礎，旨在構建分子開關檢測平臺為肺癌早期診斷以及TKI的靶向用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸埃希菌E.coliDH5α菌株(本實驗室保存)；引物(上海生工生物工程公司合成)；pMD19-T質粒(TaKaRa公司)；2×Taq PCR Master Mix，2×pfu PCR Master Mix，DNA提取試劑盒和質粒抽提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。本實驗所用引物序列引自文獻[1]。其中P1～P4用于構建EGFR基因野生型(WT)和D18MT突變重組質粒的引物，D18-S和Wide-AS用于檢測EGFR基因D18MT型突變的分子開關引物。同時合成pMD19-T 載體的一對通用引物M13-47和RV-M，用于菌液PCR。具體引物序列見表1。

表1 所用引物序列Table 1 Sequence of primers used

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取：取適量凍存的健康人血液及3例肺癌組織樣本，按血液/組織DNA提取試劑盒說明書操作提取得健康人全血基因組及肺癌組織DNA，用MD2000D微量紫外分光光度計檢測其濃度和純度。

1.2.2EGFR基因19外顯子del18bp位點片段的擴增：以上述提取的健康人全血基因組DNA為模板，據引物和高保真DNA聚合酶介導的PCR的不同搭配(表2)，用特異性引物擴增得到WT、片段A和B。反應體系：基因組DNA模板 0.5 μL，10 μmol/L引物(P1/P4或P1/P2或P3/P4)各0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix(WT)/2×pfu Master Mix(片段A或B)6.25 μL，補足ddH2O至12.5 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃/60 ℃/58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s。重疊PCR得D18MT：以片段A和B作為模板，反應體系(2×Taq PCR Master Mix)、反應條件同上(94 ℃預變性5 min，退火溫度為62 ℃)，4 ℃保存。產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行膠回收，經MD2000D微量紫外分光光度計測濃度(≥5 ng/L)或純度(A260/280:1.7～1.9)，-20 ℃保存。

表2 EGFR基因19外顯子del18bp擴增PCR反應Table 2 EGFR gene exon 19 del18bp amplification PCR reaction

1.2.3 野生型和突變型重組質粒的構建及鑒定：將WT片段和D18MT片段分別插入pMD19-T載體，再轉化至大腸埃希菌DH5α感受態細胞中，涂抹至LB/Amp/IPTG/X-Gal平板上進行藍白篩選，挑取單個白色菌落接種至含Amp的LB液體培養基，37 ℃過夜振蕩培養，即得野生型質粒和突變型質粒。每組挑取單克隆菌液進行菌液PCR，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳。菌液PCR反應體系：單克隆菌液1.0 μL為模板，100 μmol/L的RV-m和M13-47引物各0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 5.5 μL，ddH2O補足至12.5 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸78 s；72 ℃終延伸5 min；4 ℃保存。并將陽性菌液送至上海生工生物工程公司進行DNA測序。

1.2.4 突變檢測技術平臺的構建及優化：采用正交設計優化突變檢測技術平臺。以PCR中的模板量、引物量、循環數、退火溫度為正交設計的4個因素，每個因素設計3個水平。根據L9(34)正交設計表設計實驗方案如表3所示。產物經3%瓊脂糖凝膠電泳。

表3 正交設計方案L9(34)Table 3 Orthogonal design scheme L9 (34)

1.2.5 突變檢測技術平臺靈敏度的檢測：將D18MT突變模板按102、101、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6(copies/μL)稀釋，其他條件按上述確定的最優檢測條件進行PCR。產物經3%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 肺癌組織樣本的檢測：以提取的3例肺癌樣本組織DNA為模板，并以上述構建的D18MT為陽性對照，以WT為陰性對照，其他條件按確定的最優檢測條件進行PCR。產物經2%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結果

2.1 擴增EGFR基因19外顯子del18bp位點片段

單重PCR擴增產物WT片段約在484 bp處有清晰條帶(圖1A)；重疊PCR擴增產物片段A和B大小分別在約269和211 bp處有清晰條帶，D18MT在約466 bp處出現清晰條帶，與預期片段大小基本一致(圖1B)。

M:a 100 bp DNA Ladder marker；A:1,2 were WT products;B:D18MT overlapping PCR product,1.D18MT,2.fragment B,3.fragment A圖1 EGFR基因19外顯子del18bp位點片段擴增產物Fig 1 Amplification products of EGFR gene exon 19 del18bp fragment

2.2 野生型重組質粒、突變型重組質粒的構建及鑒定

所挑選4組野生型質粒、3組突變型質粒菌液PCR擴增產物目的片段均與預期一致(圖2)。

M.a 100 bp DNA Ladder marker;A.represents the PCR product of wild-type WT,1-4.wild-type plasmid;B.mutant D18MT plasmid bacterial solution identified by agarose gel electrophoresis,1-3.mutant-type plasmid圖2 野生型和突變型重組質粒菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳的結果Fig 2 PCR agarose gel electrophoresis results of wild- type and mutant recombinant plasmid bacteria

2.3 測序結果

與EGFR基因序列做BLAST同源性分析，與預期結果一致(圖3)。

A.partial results of WT sequencing；B.partial results of D18MT sequencing圖3 WT和D18MT測序部分結果Fig 3 Partial results of WT and D18MT sequencing

2.4 突變檢測技術平臺的構建及優化

突變型重組質粒與引物配對，出現分子“開”現象，野生型質粒與引物不配對，出現分子“關”現象，其中4號泳道的檢測條件分子開關現象最明顯，即EGFR基因19外顯子del18bp位點突變檢測技術的最佳條件：模板量0.4 μL，終濃度1.48×10-2μmol/L，引物量0.20 μL，終濃度0.16 μmol/L，57 ℃退火溫度，循環數25(圖4)。

M.a 100 bp DNA Ladder marker;W.a wild-type recombinant plasmid;M.a mutant recombinant plasmid,and the 4W/4M group molecular switch phenomenon is the most obvious

2.5 檢測靈敏度

片段大小在232 bp左右，與預期一致；當模板在102～10-3copies/μL時，目的條帶清晰可見(圖5)，構建的分子開關平臺可檢測出低至10-3copies/μL的突變模板。

M.a 100 bp DNA Ladder marker,1,2,3,4,5,6,7,8 were D18MT template 10-6,10-5,10-4,10-3,10-2,10-1,101,102;the PCR amplification products diluted with concentrations of 101 and 102 (copies/μL)圖5 靈敏度檢測瓊脂糖電泳結果Fig 5 Sensitivity detection agarose gel electro- phoresis results

2.6 高保真酶介導的分子開關在非小細胞癌患者癌變肺組織DNA模板的檢測

2、3號泳道有特異性擴增產物，與4號泳道(D18MT)片段大小基本一致；1號泳道無特異性擴增產物(圖6)。提示del18bp 缺失突變檢測分子開關可對臨床樣本進行特異性檢測。

M.a 200 bp DNA Ladder marker;1-3.lung cancer tissue sample 1(0.40 mg/mL),2(0.36 mg/mL),3(0.50 mg/mL),lane 4,5 were D18MT,WT圖6 分子開關在3例肺癌組織模板上的電泳檢測結果Fig 6 Electrophoretic detection of molecular switch on 3 lung cancer tissue templates

3 討論

非小細胞肺癌以其較高的發病率和病死率在醫學界備受關注，基因檢測技術在腫瘤的早期診斷中有重要價值，但其花費較高、耗時長、難以在臨床普及，更不能及時或較早發現耐藥突變的出現。癌細胞的特定體細胞突變的早期診斷有賴于更為敏感檢測技術的出現[1]。因此，高敏感性檢測EGFR基因突變方法在肺癌等腫瘤的早期篩查中和具有臨床意義。

本實驗主要針對肺癌EGFR基因D18MT突變位點，利用PCR及重疊PCR技術和瓊脂糖凝膠電泳和基因測序檢測，并在PubMed中進行BLAST同源性分析，結果顯示EGFR基因19外顯子的18堿基缺失位點突變成功，且無其他突變。再通過特異性引物擴增和正交設計構建分子開關檢測平臺，為肺癌早發現和早診斷提供基礎實驗依據。

首先，本實驗利用重疊PCR成功構建了突變型重組質粒，在實驗的第一步PCR反應后對其產物，即對目的片段進行回收，排除了其他因素的干擾，反應高效且成本較低；其次，本實驗通過設計正交實驗方案，對引物量、模板量、循環數及退火溫度進行了優化，成功找出了最優檢測條件。同時，對其模板濃度進行靈敏度檢測，以排除在高濃度時的假陽性，降低在低濃度時假陰性的發生率。當模板在103copies/μL即可檢出PCR擴增產物。將前期確定的條件應用于非小細胞肺癌組織樣本，結果提示該平臺可用于臨床樣本檢測。以此法代替直接測序法等其他方法，可使快速檢測血中游離DNA D18MT缺失突變更為靈敏可靠。然而，本次實驗有一定的局限性，并沒有對引物濃度進行條件優化，加之，本次實驗還只停留在分子水平，僅僅是對于D18MT單突變位點的檢測，后續實驗可結合與肺癌EGFR基因相關的其他基因突變如L858R等位點進行檢測，并可將此項技術運用到臨床肺癌EGFR基因的普遍篩查，用于與肺癌發生發展相關的研究。