丁苯酞減輕H2O2誘導的人臍靜脈和臍動脈內(nèi)皮細胞氧化損傷

楊曉麗，王 征，張艷茹，冀靜靜，王孟帥

(1.河北工程大學附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河北 邯鄲 056002；2.邯鄲市第一醫(yī)院 重癥醫(yī)學科，河北 邯鄲 056002；3.邯鄲市第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河北 邯鄲 056001;4.邯鄲市第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河北 邯鄲 056001 )

內(nèi)皮功能障礙在動脈粥樣硬化的病理生理過程中起著關(guān)鍵作用[1-2]，其發(fā)生機制包括氧化應激[3]。動脈粥樣硬化與卒中、心肌梗死及腎臟病變等多種疾病密切相關(guān)。因此研究如何保護內(nèi)皮功能至關(guān)重要。在研究內(nèi)皮功能時一般選用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)，人臍動脈內(nèi)皮細胞(human umbilical artery endothelial cells,HUAECs)主要用于動脈粥樣硬化的體外研究，但因HUAECs的培養(yǎng)難度較大，以往研究選用的較少。因內(nèi)皮功能與動脈粥樣硬化密切相關(guān)，因此同時選用兩種內(nèi)皮細胞研究內(nèi)皮功能可使得到的結(jié)果更加可靠。

丁苯酞主要用于治療急性缺血性卒中[4]，也可抑制神經(jīng)元凋亡[5]。但丁苯酞是否具有內(nèi)皮保護作用目前研究較少。本實驗主要研究氧化應激對血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells,VECs)造成的影響以及丁苯酞是否具有內(nèi)皮保護作用及其作用機制，為保護內(nèi)皮功能尋找新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)(上海吉凱基因細胞庫)，人臍動脈內(nèi)皮細胞(HUAECs)(北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司)。

1.1.2 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清(Gibco公司)；H2O2(河北健寧藥業(yè)有限公司)；丁苯酞(石藥集團恩必普藥業(yè))；MTT(Biosharp公司)；羅丹明123和Annexin V/PI凋亡細胞檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；Fura-4/AM(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及分組處理：將HUVECs和HUAECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素-鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

首先建立H2O2損傷模型和檢測NBP對細胞的影響。將細胞分為對照組，不同劑量H2O2干預組及NBP組(劑量：5和10 μmol/L)。根據(jù)預實驗結(jié)果H2O2劑量在50～200 μmol/L時對HUVECs沒有明顯損傷作用，但對HUAECs已顯現(xiàn)出損傷作用，因此選用300、500、700和900 μmol/L的H2O2劑量與HUVECs共培養(yǎng)24 h，選用100、200、300和400 μmol/L的H2O2劑量與HUAECs共培養(yǎng)24 h，來選取IC50值。

建立H2O2損傷模型后，接下來的實驗將細胞分為對照組，不同劑量H2O2干預組(HUVECs組H2O2劑量：700 μmol/L；HUAECs組H2O2劑量：300 μmol/L)及NBP處理組(劑量：5和10 μmol/L，在H2O2前2 h加入)。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力：兩種細胞以5×104個/mL的濃度接種于96孔板上，每孔100 μL置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。24 h后進行MTT檢測，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育4 h，小心吸掉舊培養(yǎng)基后每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床上搖10 min，溶解生成的藍紫色結(jié)晶，用酶標儀檢測490 nm波長的吸光度值。

1.2.3 羅丹明123檢測線粒體膜電位：將細胞培養(yǎng)在6孔板中，按照試劑操作說明配制細胞后加入10 μmol/L羅丹明123，在37 ℃的環(huán)境中，30 min后應用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，然后立即進行流式分析，結(jié)果用Expo 32 ADC軟件進行處理。

1.2.4 Annexin V/PI檢測凋亡細胞：將細胞培養(yǎng)在6孔板中，按照試劑操作說明配制細胞后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，保持在黑暗環(huán)境中15 min，濾過后，用流式細胞儀分析細胞凋亡率，結(jié)果用Expo 32 ADC軟件進行處理。

1.2.5 Fura-4/AM檢測細胞內(nèi)游離鈣：將細胞培養(yǎng)在6孔板中，按照試劑操作說明配制細胞后加入5 mmol/L Fluo-4/AM，40 min后用流式細胞儀測量細胞內(nèi)游離鈣的變化，結(jié)果用Expo 32 ADC軟件進行處理。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 丁苯酞對兩種血管內(nèi)皮細胞均無毒性作用

兩種劑量的丁苯酞(5和10 μmol/L)對兩種細胞存活率與對照組相比無差異(圖1)。

圖1 兩種劑量的丁苯酞對HUVECs(A)和HUAECs(B)均無明顯影響Fig 1 NBP had no effect on the cell viability of HUVECs (A)and HUAECs n=5)

2.2 H2O2刺激可導致兩種血管內(nèi)皮細胞的細胞活力下降

隨著H2O2劑量逐漸升高，HUVECs(圖2A)和HUAECs(圖2B)的細胞活力逐漸下降。與對照組相比，H2O2劑量分別為700和300 μmol/L時細胞活力下降約50%(P<0.05)，因此選取700和300 μmol/L的H2O2劑量來建立HUVECs和HUAECs的氧化損傷模型。

*P<0.05 compared with control group圖2 不同劑量的H2O2均可造成血管內(nèi)皮細胞的細胞活力下降Fig 2 Cell viability of HUVECs (A)and HUAECs (B)were assessed after various dosages of H2O2 treatment, the injury of the cells induced by H2O2 was in a dosage-dependent manner n=5)

2.3 丁苯酞可改善H2O2導致的血管內(nèi)皮細胞活力下降

兩種劑量的丁苯酞(5和10 μmol/L)提前干預HUVECs(圖3A)和HUAECs (圖3B)2 h后，再分別與700和 300 μmol/L的H2O2共培養(yǎng)24 h。與H2O2組相比，提前加入任何一種劑量的丁苯酞細胞活力都明顯升高(P<0.05)，并且丁苯酞劑量為10 μmol/L時效果更明顯。

A.HUVECs;B.HUAECs;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H2O2 group圖3 丁苯酞可改善H2O2導致的血管內(nèi)皮細胞活力下降，高劑量的丁苯酞效果更明顯Fig 3 NBP improved the decrease of cell viability in VECs induced by H2O2,and high dosage of NBP had better effect n=5)

2.4 丁苯酞可減輕H2O2介導的血管內(nèi)皮細胞線粒體膜電位下降

由于高劑量的丁苯酞作用較明顯，因此在接下來的實驗當中，選用丁苯酞的劑量為10 μmol/L。與對照組相比，H2O2刺激可導致兩種血管內(nèi)皮細胞的線粒體膜電位下降(P<0.05)，然而提前加入丁苯酞可使細胞線粒體膜電位下降的程度明顯減輕(P<0.05)(圖4)。

A.HUVECs;B.HUAECs;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H2O2 group圖4 丁苯酞可減輕 H2O2介導的血管內(nèi)皮細胞線粒體膜電位下降Fig 4 NBP reduced the decrease of mitochondrial membrane potential mediated by H2O2 in VECs n=3)

2.5 丁苯酞可抑制 H2O2介導的血管內(nèi)皮細胞凋亡

與對照組相比，H2O2刺激兩種血管內(nèi)皮細胞均可引起明顯的細胞凋亡(P<0.05)，而提前加入丁苯酞可明顯抑制H2O2引起的細胞凋亡(P<0.05)(圖5)。

A.HUVECs;B.HUAECs;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H2O2 group圖5 丁苯酞可抑制 H2O2導致的血管內(nèi)皮細胞凋亡Fig 5 NBP inhibited the apoptosis of VECs induced by H2O2 n=3)

2.6 丁苯酞可減少H2O2介導的兩種血管內(nèi)皮細胞內(nèi)鈣超載

與對照組相比，H2O2刺激可引起兩種血管內(nèi)皮細胞內(nèi)游離鈣增多(P<0.05)，而提前加入丁苯酞可明顯減少兩種細胞內(nèi)游離鈣的生成，防止鈣超載(P<0.05)(圖6)。

A.HUVECs;B.HUAECs;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H2O2 group圖6 丁苯酞可減少 H2O2導致的血管內(nèi)皮細胞內(nèi)鈣超載Fig 6 NBP reduced H2O2-induced calcium overload in VECs n=3)

3 討論

內(nèi)皮細胞是血管腔表面的單層細胞，起著物理屏障的作用，可合成和釋放多種血管活性物質(zhì)，在血管自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起著重要作用。內(nèi)皮功能障礙被認為是動脈粥樣硬化的早期標志，因此保護內(nèi)皮功能是預防動脈粥樣硬化的關(guān)鍵步驟。活性氧(ROS)包括過氧化氫(H2O2)和羥自由基(OH-)等，在許多生理和病理生理事件中起著重要作用。過量的ROS是導致內(nèi)皮功能障礙的主要原因[6-7]。過量的ROS可誘導線粒體雙層膜通透孔開放，釋放Ca2+和細胞色素C，進而引起促凋亡蛋白釋放，最后使線粒體外膜破裂，導致細胞凋亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2對兩種血管內(nèi)皮細(HUVECs和HUAECs)均可導致明顯損傷，細胞活力明顯下降，細胞凋亡增加。

大量的研究報道了丁苯酞在改善急性缺血缺氧損傷方面的神經(jīng)保護作用[9-10]，但丁苯酞是否具有內(nèi)皮保護作用并不十分清楚。本研究證實了兩種劑量的丁苯酞對H2O2誘導的兩種血管內(nèi)皮損傷均具有保護作用，高劑量的效果較明顯，這與既往的研究結(jié)果相同[11]。丁苯酞可減輕H2O2對兩種血管內(nèi)皮細胞所造成的氧化損傷，抑制細胞凋亡，表明丁苯酞可通過抗氧化作用保護內(nèi)皮細胞。

線粒體膜電位損傷是線粒體功能受損的標志，細胞內(nèi)鈣超載不僅可影響血管活性物質(zhì)正常作用的發(fā)揮，還可以導致線粒體吸收鈣增多，導致線粒體功能障礙[12]。丁苯酞可抑制H2O2介導的兩種血管內(nèi)皮細胞的線粒體膜電位下降及細胞內(nèi)鈣超載，表明丁苯酞可通過保護線粒體這一途徑來保護內(nèi)皮細胞。

綜上所述，本研究證實了丁苯酞可減輕氧化應激介導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞和臍動脈內(nèi)皮細胞氧化損傷。丁苯酞可通過提高細胞活力，抑制細胞凋亡，防止細胞內(nèi)鈣超載，改善線粒體功能等途徑保護內(nèi)皮細胞，從而預防動脈粥樣硬化的發(fā)生。本研究選用兩種血管內(nèi)皮細胞，使得到的結(jié)果更加全面和可靠，為臨床應用保護內(nèi)皮功能藥物和抗動脈粥樣硬化治療開辟了新的選擇方法。