Nrf2激活劑緩解低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)

葛 亮，向悅?cè)A，譚 旎

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 恩施 445000)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)主要特征表現(xiàn)為肺血管收縮增強(qiáng)和肺血管結(jié)構(gòu)重建，低氧會(huì)造成PAH壓力持續(xù)存在，是肺血管重建病理基礎(chǔ)[1]，因此緩解血管重構(gòu)對(duì)于PAH至關(guān)重要。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)在抗氧化中發(fā)揮重要作用，活化Nrf2可上調(diào)下游靶標(biāo)，發(fā)揮抗氧化作用，改善內(nèi)皮細(xì)胞紊亂，參與血管重構(gòu)過(guò)程[2]。Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)信號(hào)通路可調(diào)控下游靶基因磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶-1(NADPH quinineoxidoreductase-1，NQO-1)、血紅素氧合酶1(heme oxygenase1，HO1)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用[3]。推測(cè)Nrf2激活可能通過(guò)影響上述通路實(shí)現(xiàn)對(duì)PAH的保護(hù)。因此，低氧誘導(dǎo)建立PAH大鼠模型，觀察Nrf2激動(dòng)劑萊菔硫烷(sulforaphane，SFP)對(duì)PAH大鼠的影響并初步探討其作用機(jī)制，以期為臨床治療PAH提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：雄性SPF級(jí)大鼠，體質(zhì)量180～220 g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2017-0013]。飼養(yǎng)條件：光照/黑暗(12 h/12 h)、溫度(23±1)℃、濕度(55±5)%，自由飲水飲食。本研究經(jīng)恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)(文號(hào)：2019000412)。

1.1.2 試劑：SFP(TRC公司)；HE試劑盒、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物岐化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒、胞質(zhì)和核蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；一抗兔抗Nrf2、NQO1、HO1(Abcam公司)；一抗兔抗ARE(Santa Cruz公司)；基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-2、MMP-9引物(由上海生工生物工程股份有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的分組：將大鼠分為對(duì)照組、低氧組、Nrf2激活組，每組8只。Nrf2激活組低氧處理前一周每天灌胃5 mg/kg SFP，連續(xù)4周，低氧處理：低氧大鼠飼養(yǎng)艙灌入氮?dú)猓S持氧濃度于10%±0.5%，每天8 h，每周6天，共3周復(fù)制PAH模型。

1.2.2 心肺血流動(dòng)力學(xué)和右心室肥大指標(biāo)的檢測(cè)：檢測(cè)大鼠平均肺動(dòng)脈壓力(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)，剪下右心室(right ventricular，RV)，稱量RV和左心室(left ventricular，LV)+室間隔(interventricular septum，S)的重量，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)=RV/(LV+S)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即將肺動(dòng)脈組織部分置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)石蠟包埋后切片。部分置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 HE染色檢測(cè)肺血管重構(gòu)：光學(xué)顯微鏡下利用血管圖像分析儀，每只大鼠測(cè)定6條肺小動(dòng)脈血管壁面積(wall area，WA)、血管總面積(total vaseular area，TA)、血管中膜厚度(mesothelium thickness，MT)及血管動(dòng)脈外徑(external diameter of blood tubular artery，ED)，計(jì)算WA/TA、相對(duì)血管中膜厚度(MT/ED)。

1.2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA水平、SOD活性的檢測(cè)：按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)肺動(dòng)脈組織中MDA(硫代巴比妥酸法)水平、SOD(氮藍(lán)四唑法)活性。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺動(dòng)脈中MMP-2、MMP-9 mRNA水平：RNA提取試劑盒提取總RNA，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，MMP-2 上游引物：5′-TGTAAACAACTTTTGGACACATCTGGG-3′，下游引物：5′-AAATAGGTGACACGTGAAAAGTGCCTT GCA-3′；MMP-9 上游引物：5′-AGACACCTCTGCCCT CACCATGA-3′，下游引物：5′-AAGGTTAGAGAATCC AAGTTTATTAGAAACACTCC-3′；GADPH上游引物：5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游引物：5′-TT GCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1 μL、2×Mix 10 μL、F/R各0.5 μL、ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、61 ℃退火80 s，45個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法分析各組MMP-2、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 Western blot檢測(cè)肺動(dòng)脈組織中Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平：參照胞質(zhì)和核蛋白提取試劑盒說(shuō)明，分離細(xì)胞核和細(xì)胞漿，檢測(cè)Nrf2蛋白水平。蛋白裂解液裂解提取肺動(dòng)脈總蛋白，檢測(cè)ARE、NQO1、HO1蛋白水平。凝膠電泳分離蛋白質(zhì)、PVDF轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉，對(duì)應(yīng)加入一抗Nrf2、ARE、NQO1、HO1、GAPDH、Lamin B1，4 ℃孵育過(guò)夜；加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Nrf2激活對(duì)大鼠心肺血流動(dòng)力學(xué)和右心室肥大指標(biāo)的影響

與對(duì)照組相比，低氧組mPAP、RV/(LV+S)水平升高(P<0.05)；與低氧組相比，Nrf2激活組mPAP、RV/(LV+S)水平降低(P<0.05)(表1)。

表1 3組大鼠mPAP、RV/(LV+S)水平比較Table 1 Comparison of mPAP and RV/(LV+S)levels of rats in three

2.2 Nrf2激活對(duì)大鼠肺血管重構(gòu)的影響

與對(duì)照組相比，低氧組WA/TA、MT/ED升高(P<0.05)；與低氧組相比，Nrf2激活組WA/TA、MT/ED降低(P<0.05)(圖1，表2)。

圖1 3組大鼠肺動(dòng)脈HE染色情況Fig 1 HE staining of pulmonary artery in 3 groups (scale bar=100 μm)

表2 3組大鼠WA/TA、MT/ED比較Table 2 Comparison of WA/TA and MT/ED in 3

2.3 Nrf2激活對(duì)大鼠肺動(dòng)脈組織中MDA水平、SOD活性的影響

與對(duì)照組相比，低氧組肺動(dòng)脈組織中MDA水平升高(P<0.05)、SOD活性降低(P<0.05)；與低氧組相比，Nrf2激活組肺動(dòng)脈組織中MDA水平降低(P<0.05)、SOD活性升高(P<0.05)(表3)。

表3 3組大鼠肺動(dòng)脈組織中MDA水平、SOD活性比較Table 3 Comparison of MDA level and SOD activity in pulmonary artery tissues of three groups of

2.4 Nrf2激活對(duì)大鼠肺動(dòng)脈組織中MMP-2、MMP-9 mRNA水平的影響

與對(duì)照組相比，低氧組肺動(dòng)脈組織中MMP-2、MMP-9 mRNA水平升高(P<0.05)；與低氧組相比，Nrf2激活組肺動(dòng)脈組織中MMP-2、MMP-9 mRNA水平降低(P<0.05)(表4)。

表4 3組大鼠肺動(dòng)脈組織中MMP-2、MMP-9mRNA水平比較Table 4 Comparison of mRNA levels of MMP-2 and MMP-9 in pulmonary artery of rats in 3 groups

2.5 Nrf2激活對(duì)大鼠肺動(dòng)脈組織中Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平的影響

與對(duì)照組相比，低氧組肺動(dòng)脈組織中胞核Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平升高(P<0.05)，胞質(zhì)Nrf2蛋白水平降低(P<0.05)；與低氧組相比，Nrf2激活組肺動(dòng)脈組織中胞核Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平升高(P<0.05)，胞質(zhì)Nrf2蛋白水平降低(P<0.05)(圖2，表5)。

圖2 3組大鼠肺動(dòng)脈組織中Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平Fig 2 Protein levels of Nrf2,ARE,NQO1 and HO1 in pulmonary artery tissue of rats in 3 group

表5 3組大鼠肺動(dòng)脈組織中Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平比較Table 5 Comparison of Nrf2,ARE,NQO1,HO1 protein levels in pulmonary artery of rats in 3 8)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，改善肺血管阻力和肺動(dòng)脈順應(yīng)性，可以減緩血管重構(gòu)，亦是目前治療PAH的主要方法[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧組mPAP升高，低氧環(huán)境大鼠發(fā)生PAH。右心室肥厚指數(shù)RV/(LV+S)、WA/TA、MT/ED升高，低氧環(huán)境較常氧大鼠血管重構(gòu)形成。

PAH肺血管組織內(nèi)氧自由基生成過(guò)多，進(jìn)而促使肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成內(nèi)皮血管屏障功能喪失，且MDA、SOD共同作用于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖增加、凋亡減少，導(dǎo)致血管壁增厚[5-6]。提示PAH肺動(dòng)脈組織中氧化應(yīng)激水平升高，組織中清除自由基能力降低，過(guò)氧化程度加重，機(jī)體氧化應(yīng)激嚴(yán)重，肺動(dòng)脈組織損傷嚴(yán)重。低氧刺激肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，由收縮型變?yōu)楹铣杀硇涂煞置贛MP-2、MMP-9能力，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)形成[7]。提示PAH中MMP-2、MMP-9水平升高，平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換導(dǎo)致肺血管重構(gòu)形成。

Nrf2作為內(nèi)源性抗氧化途徑中樞轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控抗氧化因子表達(dá)[8]。抗氧化治療可激活Nrf2通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化從而抑制肺血管重構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)PAH的保護(hù)[9]。Nrf2/ARE信號(hào)通路直接影響細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，形成異二聚體可與ARE結(jié)合，同時(shí)可招募輔助轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)抗氧化應(yīng)激、抗炎損傷、抗細(xì)胞凋亡等多種功能，從而維持細(xì)胞環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定[10]。NQO1、HO1作為Nrf2/ARE信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子，是抗氧化應(yīng)激蛋白，具有抗氧化損傷作用[11]。PAH狀態(tài)下發(fā)生氧化應(yīng)激，刺激Nrf2核轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)對(duì)PAH的保護(hù)，但該保護(hù)水平有限，最終結(jié)果仍然加重PAH進(jìn)程。激活Nrf2促進(jìn)Nrf2入核，Nrf2入核后與ARE結(jié)合，招募NQO1、HO1實(shí)現(xiàn)抗氧化，同時(shí)減緩平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，減少血管重構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)PAH的保護(hù)。

綜上所述，Nrf2激活可抑制PAH肺動(dòng)脈血管重構(gòu)，可能是通過(guò)實(shí)現(xiàn)抗氧化途徑實(shí)現(xiàn)的。但影響血管重構(gòu)途徑較多，Nrf2亦可能通過(guò)別的相關(guān)途徑抑制血管重構(gòu)，也是本研究接下來(lái)的研究重點(diǎn)。