過表達內質網蛋白29抑制人卵巢癌細胞系OVCAR3侵襲和遷移

董莉麗，馮 磊，楊 然，李 松，饒玉梅

(1.南陽市中心醫院 婦科，河南 南陽 473000;2.鄭州大學第一附屬醫院 婦科，河南 鄭州 450000)

卵巢癌(ovarian cancer)是婦科常見3大惡性腫瘤之一，過去10年間，中國卵巢癌發病趨于年輕化，發病率增長30%，病死率增加18%[1]。由于卵巢癌發病隱匿且缺少確切前期診斷方式，70%以上確診時已進入中晚期，多數發生侵襲與轉移，失去手術機會，僅能采取放射治療、化學藥物治療等姑息治療措施，預后差[2]。因此，探索抑制卵巢癌細胞遷移和侵襲的有效方式，對改善其預后有重要意義。內質網蛋白29(endoplasmic reticulum protein 29，ERP29)是影響細胞增殖、轉移的內質網蛋白之一，在多種腫瘤細胞中異常表達，參與乳腺癌、肺腺癌及結直腸癌的發生與發展[3-5]。本課題組經前期研究發現ERP29在卵巢癌組織中異常低表達，ERP29可能作為抑癌基因參與發病進程，但關于其對卵巢癌細胞侵襲、遷移的影響及具體機制仍需進一步探討。本研究建立過表達ERP29的OVCAR3細胞系，探討其對細胞遷移、侵襲的影響，并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系:人卵巢癌細胞系OVCAR3(中國科學院上海細胞庫)，保存于液氮中。

1.1.2 主要試劑:攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的真核表達載體pcDNA3.1-ERP29質粒、陰性對照載體pcDNA3.1 empty質粒(上海吉瑪制藥技術有限公司)；LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogen公司)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time-quantitative-polymerase chain reaction，RT-qPCR)SYBR Ⅱ試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量分析試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、p-AKT、雷帕霉素靶蛋白(mam-malian target of rapamycin，mTOR)、p-mTOR、真核生物始動因子4E結合蛋白1(4E binding protein，4EBP1)、p-4EBP1一抗(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養、轉染及分組：將OVCAR3細胞培養于RPMI-1640培養基中(10%胎牛血清+1%抗青霉素、鏈霉素混合液)，常規條件5% CO2、37 ℃下培養至對數期行后續實驗。調整細胞濃度為1×105個/mL，重新接種至6孔板，待細胞再次匯合至70%時，按LipofactamineTM2000試劑盒說明書進行轉染。分為過表達組、空載組、對照組。過表達組用脂質體轉染法轉染ERP29過表達RNA重組真核載體pcDNA 3.1-ERP29質粒，空載體組轉染陰性對照載體pcDNA 3.1 empty質粒，對照組不做處理。3組均設5個復孔，37 ℃培養6 h后更換為完全培養基，繼續培養36 h。熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.2.2 RT-qPCR檢測細胞中ERP29 mRNA表達量：取各組細胞，經PBS洗滌用Trizal法提取細胞總RNA，用反轉錄試劑盒獲得對應的互補RNA(complementary RNA,cRNA)，定量后按熒光定量試劑盒說明書要求設置反應體系：上、下游引物(終濃度0.2 μmol/L)1.0 μL，2×Power qPCR PreMix 10 μL，DNA模板2.0 μL，加雙蒸水至20 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個循環。β-actin為內參基因，2-△△Ct法計算。引物序列：5′-TGCAGTGCAGTGC ACGCATGCTCA-3′(F)，5′-GTGCACACGGTTGTGTC CACCAAC-3′(R)。

1.2.3 Transwell小室實驗測定細胞侵襲：將Matrigel(1∶9稀釋)預先鋪設于孔徑8 μm、24孔趨化板Transwell小室中，恒溫箱內膠干，取各組細胞無血清培養基上清液(培養24 h后)，下、上室中加入各組單細胞懸液，同條件培養24 h，取杯底濾膜，加入結晶紫避光染色、4 %多聚甲醛固定。取5個隨機視野，顯微鏡下觀察并記錄穿膜細胞數。

1.2.4 劃痕實驗測定細胞遷移：胰蛋白酶消化重懸，調整細胞為1×105個/mL，接種至6孔板，細胞增殖至貼壁棄去培養基，用無菌槍頭在孔中間畫一條直線，用PBS沖洗直線邊緣細胞至脫落，拍照記錄初始劃痕距離，加入完全培養基繼續培養24 h，拍照記錄新劃痕距離，計算出各組遷移率。遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.5 Western blot測定細胞中AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、4EBP1和p-4EBP1蛋白表達：用PBS沖洗，加入預冷RIPA裂解液，靜置10 min后離心，BCA法測蛋白總量。沸水浴5 min使蛋白變性，取50 μg樣本混合上樣緩沖液，SDS-PAGE凝膠電泳，轉移至硝酸纖維素膜，加入5%脫脂奶粉封閉1 h，加入AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、4EBP1和p-4EBP1一抗(1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌3次，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶8 000)，室溫孵育2 h后放入暗室顯色、曝光，用Image J軟件分析吸光度值，目的基因條帶吸光度/內參β-actin條帶吸光度即為蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 轉染效率的測試

過表達組、空載組均有GFP綠色熒光蛋白表達，轉染效率均大于80%，可用于后續實驗(圖1)。

圖1 過表達組與空載體組轉染效率觀察Fig 1 Transfection efficiency of over-expression and empty vector groups

2.2 轉染后各組ERP29 mRNA相對表達量對比

與對照組和空載組對比，過表達組ERP29 mRNA相對表達量升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組ERP29表達水平Table 1 ERP29 expression levels in each

2.3 各組細胞侵襲能力對比

與對照組和空載組對比，過表達組穿膜細胞數減少(P<0.05)(表2,圖2)。

圖2 Transwell小室法觀察各組穿膜細胞數Fig 2 Transwell experiment observation of the number of transmembrane cells in each group

表2 各組穿膜細胞數對比Table 2 Comparison of the number of penetrating cells

2.4 各組細胞遷移能力對比

與對照組、空載組對比，過表達組遷移率降低(P<0.05)(圖3,表3)。

圖3 劃痕實驗觀察各組遷移能力Fig 3 Scratch experiment to observe the migration ability of each groups(×100)

表3 各組細胞遷移能力對比Table 3 Comparison of cell migration ability of each

2.5 各組細胞p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1值對比

與對照組、空載體組對比，過表達組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1值降低(P<0.05)(圖4，表4)。

圖4 Western blot實驗測定AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白表達量Fig 4 Western blot experiment to determine the protein expression of AKT,p-AKT,mTOR,p-mTOR, 4EBP1,p-4EBP1

表4 各組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1值對比Table 4 Comparison of p-AKT/AKT,p-mTOR/mTOR,p-4EBP1/4EBP1 values in each group

3 討論

卵巢癌惡性程度極高，病死率居女性生殖系統惡性腫瘤之首[6]。關于其機制尚未完全闡明，通常認為與基因突變、遺傳因子不穩定及基因異常表達有關[7-8]。目前,腫瘤細胞減滅手術輔以聯合化學藥物治療(簡稱化療)是卵巢癌的主要治療方式，患者生存率得以提高，然而由于化療耐藥性的存在，5年生存率仍不足30%[9]。癌細胞的侵襲和遷移是導致治療失敗及患者死亡的主因。因此，探索抑制卵巢癌細胞侵襲遷移能力的有效方法至關重要。

ERP29最早在大鼠牙釉質細胞被發現，廣泛分布于各種組織器官。ERP29作為內質網分子伴侶蛋白參與非折疊蛋白質反應，促使新生蛋白向正確的空間結構折疊，并有助于因應激而失活的蛋白質恢復正常，其上調可抑制細胞的遷移和侵襲能力，而下調具有相反作用，可通過抑制上皮間質轉化過程、影響Wnt/β-catenin信號傳導途徑來阻止細胞轉移。卵巢癌細胞中ERP29表達顯著低于臨近非腫瘤組織，且表達水平與腫瘤病理特征具有相關性，提示ERP29在卵巢癌細胞中低表達，參與卵巢癌進程[10]。本研究結果顯示，與對照組和空載體組比較，過表達組ERP29表達升高，穿膜細胞數減少，遷移率降低，提示ERP29過表達可顯著抑制OVCAR3細胞侵襲、遷移，與報道的結論相似[11]。

AKT/mTOR信號通路是細胞增殖的關鍵信號通路，廣泛存在于各種細胞中，研究認為其活性異常增強與惡性腫瘤的發生、發展有著密切關系[12]。AKT是一種高度保守的絲氨酸蘇氨酸蛋白酶，是維持細胞正常功能的關鍵信號分子，通過磷酸化為p-AKT被激活。mTOR蛋白是絲氨酸蘇氨酸蛋白酶，是AKT下游重要靶點之一，被p-AKT激活后通過調控真核起始結合蛋白4EBP1，調節蛋白質合成從而影響細胞增殖。AKT/mTOR信號通路異常高表達于卵巢癌中[13]，采取對應干預措施使該通路失活，可減弱卵巢癌的惡性生物學特性。本研究結果顯示，與對照組、空載組相比，過表達組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1值降低，提示上調ERP29對卵巢癌細胞侵襲、遷移能力的抑制作用可能與下調AKT、mTOR、4EBP1磷酸化有關。

綜上所述，過表達ERP29可抑制卵巢癌細胞系侵襲、遷移，可能通過下調AKT、mTOR、4EBP1磷酸化發揮作用。本研究仍存在一定不足，在實驗條件的限制下僅通過單一細胞系研究ERP29的作用略顯牽強，在后續實驗中將采用病毒感染或增加對照實驗的方式進行更為深入的探索。